Анализ влияния почвенных бактерий, стимулирующих рост растений, на развитие сельскохозяйственных культур

Мы изучаем, как полезные бактерии в почве помогают растениям расти быстрее и лучше. Такие природные решения могут повысить урожай и снизить затраты фермеров — а значит, сделать продукты доступнее для всех

“

Анализ бактерий благоприятно влияющих на рост растений, играет ключевое значение в развитии устойчивого земледелия

Седых Сергей Евгеньевич

Какие вызовы стоят перед нами?

Истощение почвы

Интенсивное земледелие истощает почву, что приводит к снижению урожайности и ослаблению устойчивости агросистем
Улучшение экологической среды

Широкое использование минеральных удобрений ухудшает состояние окружающей среды и негативно сказывается на качестве сельскохозяйственной продукции
Нехватка исследований

Ростостимулирующие почвенные бактерии применяются ограниченно из-за недостатка научных исследований и практических рекомендаций

Наша работа в числах

7

Человек принявших вызов
12

Изученных сортов
60

Контейнеров с ростками
555

Высаженных семян

Бактериальные культуры

Мы исследуем влияние трёх видов почвенных бактерий, которые обладают ростостимулирующими свойствами. Каждая из них взаимодействует с растениями по-разному, и вместе они помогают нам понять, как улучшить рост сельскохозяйственных культур с помощью природных решений

Pseudomonas fluorescens

Палочковидные грамотрицательные сапротрофные бактерии. Примечательны широким ареалом обитания и обычно встречаются в почве, воде, на поверхности растений и в ризосфере
Bacillus megaterium

Вид грамположительных палочковидных бактерий, особенно известный тем, что в больших количествах содержится в почве и способствует росту растений. Клетки этих бактерий способны вырабатывать самые разнообразные химические соединения
Stenotrophomonas maltophilia

Грамотрицательная, аэробная, неферментирующая бактерия, имеет палочковидную форму, широко распространенная в окружающей среде, для передвижения имеет жгутики

Двулетнее растение семейства
Капустные, возделываемое как однолетнее.
Сорт: дракон

Однолетнее растение семейства Бобовые.
Сорта: СЛ-1, СЛ-2, СЛ-3, СЛ-4, СЛ-5

Горох

2

Дайкон

4

Однолетнее растение семейства Астровые.
Сорта: классик и экспресс

Подсолнечник

3

Однолетнее растение семейства Злак

Кукуруза

1

В рамках нашего проекта мы исследуем влияние почвенных бактерий на разные типы сельскохозяйственных культур. Мы выбрали 4 растения с разными биологическими особенностями и агрономическим значением

Растительные культуры

Методы эксперимента

Подготовка семян

На первом этапе мы проводили подготовку семян кукурузы, подсолнечника, гороха и дайкона. Их отбирали по размеру и внешнему виду, затем стерилизовали с использованием раствора перекиси водорода и промывали дистиллированной водой. Это было необходимо, чтобы исключить влияние посторонней микрофлоры на результаты. Основы промывали дистиллированной водой, а также проходили термическую обработку в автоклаве для обеспечения стерильных условий при посадке

Культивирование бактерий

На протяжении эксперимента мы также регулярно культивировали используемые штаммы бактерий. Они высевались на питательные среды в чашках Петри и инкубировались при контролируемой температуре. Это было важно для поддержания жизнеспособности микроорганизмов

Окрашивание бактерий

Чтобы подтвердить тип бактериальных клеток и оценить чистоту культуры, мы проводили окрашивание по Граму. Подготовленные мазки с бактериальной культуры обрабатывались красителями, после чего изучались под микроскопом. Это позволяло визуально дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии

Инокуляция бактерий

После стерилизации семян мы проводили инокуляцию, обрабатывали их консорциумом бактерий с ростостимулирующими свойствами. Предварительно бактерии выращивались на питательной среде. Это позволяло микроорганизмам закрепиться на поверхности семени и начать взаимодействие с растением уже на начальных стадиях роста

Морфометрия

На протяжении всего эксперимента мы фиксировали морфометрические показатели растений. Эти данные позволили нам судить о влиянии различных штаммов бактерий на рост и развитие сельскохозяйственных культур. Все измерения проводились вручную с использованием линейки, штангенциркуля и программы для фиксации данных

Выделение нуклеиновых кислот

После завершения вегетационного периода мы взяли образцы корней и листьев наших культур и выделили из них РНК. Использовались наборы реагентов и буферов, подходящие для растительных тканей. Образцы гомогенезировали, обрабатывали, после чего выделенную РНК очищали и осаждали

Выделение ДНК из бактерий

Для постановки ПЦР мы выделяли ДНК из бактерий. Сначала отбирали аликвоты суспензий бактериальных культур, а затем инкубировали при 95°C в течение 10 минут. Далее образцы центрифугировали и отбирали супернатант. Полученную ДНК использовали для анализа бактерий на наличие генов обуславливающих полезные свойства бактерий

Проведение ПЦР

На выделенной РНК мы проводили ПЦР с использованием праймеров. Это помогало подтвердить, какие именно бактерии присутствовали в образцах и насколько эффективно они заселили растения. Реакции проводились в амплификаторе, после чего результаты анализировались с помощью гель-электрофореза

Агарозный гель

Для анализа продуктов амплификации мы готовили 2% агарозный гель. Для этого мы готовили навески агарозы, растворяли её в TAE буфере и нагревали до полного растворения. Далее добавляли краситель бромистый этидий и заливали раствор в форму с гребёнкой. После застывания гель был готов к проведению электрофореза

Гель электрофорез

Мы использовали агарозный гель для анализа результатов ПЦР. После реакции амплифицированные фрагменты ДНК наносили в лунки геля и проводили электрофорез. Под действием тока ДНК перемещалась по гелю, и мы могли увидеть, какие фрагменты получились — по наличию полос и их размеру. Это позволяло подтвердить, что нужные гены действительно были обнаружены

Статистическая обработка данных

Все собранные данные мы заносили в таблицы и обрабатывали с помощью статистических программ. Проводили сравнение между контрольными и опытными группами, рассчитывали средние значения. Это помогло определить, какие бактериальные штаммы реально оказали положительное влияние на рост растений

График кривых плавления

После проведения ПЦР мы анализировали графики кривых плавления для оценки специфичности амплификации. Полученная кривая показывает температуру, при которой происходит плавление ДНК. Если кривая имеет один чёткий пик — значит, амплификация была специфичной и получен только один целевой продукт. Несколько пиков могут указывать на наличие неспецифических ампликонов или димеров праймеров

Результаты эксперимента

Культивирование бактерий

Бактерии посадили на четыре среды, чтобы проверить, могут ли они фиксировать азот, усваивать фосфор и выделять сидерофоры — вещества, помогающие захватывать железо. Активность определяли по осветлению среды. В итоге: часть бактерий фиксировала азот, некоторые растворяли неорганический фосфат, а сидерофоры выделяли все. Органический фосфат не усвоил никто

Анализ кукурузы

Анализ влияния бактерий на рост кукурузы сорта L2M3 показал, что обработка Pseudomonas fluorescens увеличивает рост проростков на 77,9% (p<0,01), в то время как другие варианты не дали значимых результатов. Также Pseudomonas fluorescens и Bacillus megaterium усиливали экспрессию генов ферментов фосфоенолпируваткарбоксилазы и рибулозобисфосфаткарбоксилазы в листьях

Анализ подсолнечника

Bacillus megaterium увеличил рост проростков гороха сорта СЛ-5 в 3,3 раза (p<0,01), Pseudomonas fluorescens стимулировал экспрессию рибулозобисфосфаткарбоксилазы в листьях, а Stenotrophomonas maltophilia и консорциум активировали ферменты в корнях; при этом Stenotrophomonas maltophilia замедлял рост проростков сорта СЛ-3 на 29,9% (p=0,04)