Оценка фенотипического профиля противораковых препаратов

Анализ влияния противораковых препаратов на фенотипический профиль клетки

Направление: Генетика и биомедицина

Актуальность

Цель

Cell Painting — это метод в клеточной биологии и фармакологии, который позволяет одновременно визуализировать и количественно анализировать пространственную организацию различных компонентов клетки с помощью флуоресцентных красителей. полученный массив данных обрабатывается, для составления тепловой карты. Это упрощает поиск новых терапевтических мишеней

Сравнить воспроизводимость фенотипических профилей противораковых препаратов, полученных на клеточной линии A549 методом Cell Painting на двух микроскопах разных производителей — Thermo Scientific и Zeiss.

Подобрать посевную дозировку и концентрации препаратов, инкубировать образцы 4 дня, затем зафиксировать и окрасить клетки по протоколу Cell Painting.

Получить мультиканальные флуоресцентные изображения с помощью конфокального микроскопа Zeiss.

Обработать изображения в CellProfiler для сегментации клеток и извлечения признаков, нормализовать данные на Python, провести кластеризацию данных.

Сравнить кластерные структуры и сформулировать вывод о воспроизводимости метода

Задачи

Разработать вспомогательный инструмент визуализации (Python) для интерактивной настройки яркости каналов с целью подготовки качественных иллюстративных материалов и визуального контроля качества исходных изображений перед анализом

Подбор посевной дозировки и концентрации препаратов для cell painting

В ходе подбора была выбрана оптимальная концентрация клеток на лунку для short incubation (4e3), в связи с тем что оптимальной конфлюэнтностью для клеток является значение в 82%

Подбор концентрации препаратов при которой клетки не погибали, велся по Z схеме через титровку, от 1000 нМ до 1 нМ

Была подобрана оптимальная концентрация препаратов:

1000

100

PhenoVue Fluor Hoechst 33342 Nuclear Stain

применяется для окраски ядер. он связывается с малой бороздкой днк, преимущественно в аденин - тимин богатых участках. его флуоресценция многократно усиливается в комплексе с днк

PhenoVue Fluor 488 Concanavalin A

Связывается с концевыми остатками α-D-маннозы и α-D-глюкозы, которые в обилии преобладают в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме.

PhenoVue 512 Nucleic Acid Stain

Проницаемый РНК-связывающий краситель что накапливается в ядрышках. позволяет оценить их размер, форму, и количество

PhenoVue Fluor 568 - Phalloidin, PhenoVue Fluor 555 – WGA

Phalloidin специфически связывается с F-актином, маркируя цитоскелет, а WGA нацелен на сиаловую кислоту и N-ацетилглюкозамин, окрашивая плазматическую мембрану и аппарат Гольджи.

PhenoVue 641 Mitochondrial Stain

Краситель проникает в активные митохондрии и притягивается к отрицательно заряженному матриксу. Позволяет оценить структурные изменения в митохондриях

Изображения клеток линии A549 в 96-луночном планшете после окрашивания по протоколу Cell Painting были получены методом конфокальной микроскопии

Мы получили сырые снимки в формате .tif . Они представлены в 5 спектральных профилях + brightfield. В дальнейшем они были подвергнуты обработке

На языке python, была написана программа для интерактивной настройки яркости каналов с целью подготовки качественных иллюстративных материалов и визуального контроля качества исходных изображений перед анализом. В ней можно менять контрастность и яркость изображений полученных в ходе микроскопии, в 5 разных каналах, и объединять изображение из 3 любых каналов в одно

Пример фотографий

ThermoScientific

Zeiss

Кластеризация данных

Построение тепловой карты

Было извлечено около 5000 признаков на каждую клетку в поле зрения. Был получен огромный массив данных в формате .csv за каждый спектральный профиль. Общий вес файлов составил более 35 гб. Полученные данные были подвергнуты обьединению и усреднению. К данным применили алгоритмы нормализации и понижения размерности. В конечном итоге вес файлов сократился с 35 гб до 200 Мб. Полученные данные подвергли кластеризации через Phenograph и визуализации через UMAP.

Также, сырые данные были обработаны в программе CellProfiler. В ходе обработки, были получены данные в формате .csv за каждый спектральный канал.

Конфокальная микроскопия — метод оптического сканирования, при котором лазерный луч точечно освещает образец, а диафрагма отсекает расфокусированный свет, позволяя получать четкие послойные 3D-изображения высокого разрешения за счет перемещения зеркал и обьекива

Выводы

Подобраны концентрации препаратов и посевная дозировка
(4000 клеток на лунку)

Был разработан и применён вспомогательный инструмент визуализации (Python) для интерактивной настройки яркости каналов с целью подготовки качественных иллюстративных материалов и визуального контроля качества исходных изображений перед анализом.

По результатам проведенных исследований изученные препараты похожи друг на друга в рамках одного микроскопа, но не похожи между микроскопами.

Научные наставники