ИММУННЫЙ КАМУФЛЯЖ

или биофабрикация моделируемой пространственной матрицей

Можно ли собрать тканеинженерную конструкцию в магнитном поле?
Биофабрикация - комплекс технологий, позволяющих искусственно создавать живые тканеинженерные конструкции для регенеративной медицины

Актуальность

Одной из наиболее серьезных проблем современной трансплантологии остается критическая нехватка донорских органов.


Вторая проблема — это иммунный конфликт пересаживаемого органа и организма пациента.

Цель работы
Создание трехмерной тканеинженерной конструкции на основе генетически модифицированных низкоиммуногенных клеток с использованием физических полей.
Задачи
Получение генетически модифицированной линии HEK293FT
Нокаут гена B2M и эктопическая экспрессия HLA-E в линии HEK293FT для создания модельной системы.
Оценка жизнеспособности клеток
Тестирование жизнеспособности модифицированной линии HEK293FT при различных концентрациях парамагнетика.
Формирование клеточных сфероидов
Создание 3D-структур (сфероидов) на основе линии HEK293FT для моделирования тканевой организации.
Магнитная левитация и анализ конструкций
Определение оптимальной концентрации парамагнетика для магнитной левитации, формирование тканеинженерных конструкций и их последующий анализ.

Блок 1. Геномное редактирование

Какие модификации были сделаны?
Для того чтобы добиться снижения иммуногенности клеток, мы нокаутировали ген B2M и вызвали эктопическую экспрессию HLA-E.

Нокаут гена B2М нарушит сборку всех белков HLA 1 класса, так как он является общей субъединицей для данных белков.

Главная функция молекул HLA I класса — представление (презентация) фрагментов чужеродных или собственных белков изнутри клетки на ее поверхность. Это позволяет цитотоксическим Т-лимфоцитам (клеткам иммунной системы) распознавать инфицированные или мутировавшие клетки и уничтожать их.

Трансфекция

Суть этого метода заключается в доставке генетического материала внутрь клетки с помощью липидных капсул. Мы подготовили липокомплекс, сформировав смесь из целевых плазмид и липидных частиц.

В процессе трансфекции эти капсулы поглотились клетками.

Схема трансфекции клеток
1. pegRNA attP_B1_mCherry
2. pegRNA attP_B2_mCherry
3. Cas_nick_RT_GFP
4. pCAGGS_HLA-E SCT_attB
5. Bxb1

Проверка результатов спустя 48 часов после трансфекции

Сортинг клеток на проточном цитометре FACS Aria III


После инкубации мы провели клеточный сортинг, чтобы отобрать клетки, которые флуоресцируют и в зелёном, и в красном спектре одновременно.

Примерно 30 процентов клеток светились в зеленом и красном диапазонах, но для большей точности мы отобрали всего 21 процент.

График интенсивности флюорисценции GFP и mCherry
Иммунофлуоресцентное окрашивание функционального белка HLA-E в трансфицированных клетках

Подтверждение событий геномного редактирования


Генетическая модификация линии HEK293FT прошла успешно: мы получили стабильную экспрессию функционального белка HLA-E в трансфицированных клетках. Это подтверждено данными иммунофлуоресцентного окрашивания.

Блок 2. Формирование "строительных блоков" для тканеинженерной конструкции

Формирование клеточных сфероидов

3D молд 3D-чашка Петри Клетки НЕК293FT

Как формируются сфероиды

  1. 1
    Подготовка 3D-молда Молд с микро-углублениями задаёт форму и размер будущих сфероидов.
  2. 2
    Внесение суспензии клеток Клетки линии HEK293FT в питательной среде равномерно распределяются по лункам.
  3. 3
    Перенос в 3D-чашку Петри Молд помещается в чашку, клетки оседают в микро-лунках и начинают агрегировать.
  4. 4
    Созревание сфероидов За 24–72 часа клетки формируют плотные трёхмерные структуры, готовые к экспериментам.

Формирование сфероидов

На данном слайде вы можете видеть процесс формирования клеточных сфероидов на основе нашей генетически модифицированной клеточной линии HEK 293 FT.

Клетки экспрессируют молекулу HLA-E — неклассический MHC I класса, играющий ключевую роль в иммунном надзоре и взаимодействии с рецепторами NK-клеток. Экспрессия подтверждается через тест на антитела красной флуоресценцией фикоэритрина.

Сфероиды используются как физиологически релевантная модель для биофабрикации, изучения клеточных взаимодействий, скрининга лекарственных препаратов и разработки подходов клеточной терапии.

Хронология формирования сфероидов 30 мин — 72 ч
Сфероиды HEK 293 FT под флуоресцентным микроскопом

Хронология формирования

T = 30 мин
Начальная агрегация
Клетки образуют первичные контакты, формируются рыхлые кластеры
T = 24 ч
Уплотнение структуры
Стабилизация GFP-сигнала, формирование плотных межклеточных контактов
T = 48 ч
Компактизация
Завершение структурной организации, активный рост сфероида
T = 72 ч
Зрелый сфероид
Выраженная экспрессия HLA-E по всему объёму

Временной контроль

Отслеживание морфологии на каждом этапе — от первого часа до полного созревания

GFP-репортер

Зелёный флуоресцентный белок визуализирует жизнеспособные трансфицированные клетки

HLA-E экспрессия

Красный сигнал подтверждает успешную генетическую модификацию по всему сфероиду

DAPI-ядра

Синий канал подтверждает плотность клеточной упаковки в 3D-структуре

Блок 3. Оценка жизнеспособности клеток HEK293FT

ХТТ-тест для оценки жизнеспособности клеток

ХТТ-тест оценивает метаболическую активность клеток по восстановлению тетразолиевого красителя

Схема XTT-теста
Результаты XTT-теста

Результаты ХТТ-теста для клеточных линий HEK293 FT и HEK293 FT Δ B2M HLA-E через 24 и 48 часов

Применение хелатного комплекса Gd³⁺
Лаборатория биофармацевтики

Парамагнитный агент, применяющийся в научных исследованиях

МРТ-изображения мозга

Контрастное вещество для улучшения качества изображений при проведении МРТ

Флакон Омнискан

Готовые препараты на основе Gd³⁺

Live/Dead Cell Viability Assay

Два цвета — один ответ о жизнеспособности клеток

Флуоресцентный анализ с использованием Calcein AM и Ethidium homodimer-1 позволяет за минуты отличить живые клетки от погибших в культурах HEK293FT и HEK293FT_delB2M_HLAE.

Calcein AM

Живые клетки

Проникает через интактную мембрану и под действием внутриклеточных эстераз превращается в зелёный флуоресцентный кальцеин.

Ex / Em
495 / 515 нм
Канал
FITC

Ethidium homodimer-1

Мёртвые клетки

Не проникает через живую мембрану. Связывается с ДНК клеток с нарушенной целостностью, давая ярко-красную флуоресценцию.

Ex / Em
528 / 617 нм
Канал
Texas Red

Принцип двойного мечения

Клетки инкубируются в смеси красителей — результат виден сразу

Интактная мембрана → зелёный сигнал
Повреждённая мембрана → красный сигнал
Результаты LIVE/DEAD test

Блок 4. Инженерная часть

Магнитная биосборка фиксированных сфероидов (200 мМоль Gd3+)
4х Timelapse Video
Для формирования трехмерной тканеинженерной конструкции была использована установка для магнитной биофабрикации.

Принцип её работы основан на создании неоднородного магнитного поля, которое позволяет управлять пространственным расположением клеточных сфероидов.


Изображения
трехмерной тканеинженерной конструкции после 24 часов созревания
(50 мМоль Gd3+)
  • Парфенов Владислав Александрович
    научный руководитель
    доктор технических наук,
    директор Научно-производственного центра медицинских изделий и клеточных продуктов НИИТФА

  • Захарова Ирина Сергеевна

    научный руководитель
    кандидат биологических наук, начальник лаборатории геномных технологий и тканевой инженерии НИИТФА (Росатом)
  • Ломов Роман Андреевич
    научный наставник
    лаборант кафедры анатомии и гистологии человека
    ИКМ им. Н. В. Склифосовского ПМГМУ им. И. М. Сеченова (Сеченовский университет)
  • Волик Тамара Владимировна
    научный наставник
    младший научный сотрудник лаборатории геномных технологий и тканевой инженерии НИИТФА (Росатом)
  • Одажиу Олеся
    г. Мурманск
  • Хрипушина Анастасия
    г. Воронеж
  • Ивушкова Ксения
    г. Санкт-Петербург
  • Старченко Елизавета
    г. Ставрополь
  • Барсукова Ксения
    г. Майкоп
  • Фартуков Александр
    г. Ленинск-Кузнецкий
Наша галерея