Эффективность использования различных биологических материалов для генетического мониторинга в молочном скотоводстве

Погрузитесь в мир молочного скотоводства с нашим проектом

АО «Рассвет» — Генетика маркерных генов и продуктивность КРС

Актуальность

В России длительная ориентация на зарубежные племенные линии повлекла за собой скрытый инбридинг, что привело к снижению оплодотворяемости и падению результативности дорогого сексированного семени. Дефицит отечественных быков с целевыми генотипами приводит к спаду экономической эффективности. Генетический мониторинг в скотоводстве обеспечивает прогнозирование селекционной родительской пары на основе ДНК-генотипирования. Это позволяет поддерживать воспроизводство высокопродуктивных телят, сохраняя баланс стада и рентабельность производства.

Объект исследования: буккальный эпителий и молоко
Метод: Аллель-специфичная ПЦР, Аллель-специфичная ПЦР с рестрикцией, Аллель-специфичная ПЦH с зондами (Taqman)
Биоматериал: Буккальный эпителий · Молоко

Цель проекта

Генотипирование крупного рогатого скота АО «Рассвет» по маркерным генам для выявления оптимальных вариантов скрещивания и прогнозирования высоких показателей продуктивности у потомства.

Корова голштинской породы на ферме АО Рассвет

Гипотеза проекта

Генотипирование коров по маркерным генам позволит достоверно прогнозировать продуктивность потомства и обоснованно подбирать пары для скрещивания — сокращая разрыв между генетическим потенциалом стада и его реальной продуктивностью.

Задачи проекта

Выделить ДНК из буккального эпителия и молока и сравнить разные способы

Освоить методику выделения ДНК из двух альтернативных источников — буккального эпителия и молока, обеспечив пригодность препарата для последующего анализа. Сопоставить различные протоколы выделения ДНК по качеству, выходу и воспроизводимости, чтобы выбрать оптимальный для условий стада АО «Рассвет».

Буккальный эпителий Молоко Чистота ДНК

Выявить аллели хозяйственно-полезных признаков при помощи аллель-специфичной ПЦР, ПЦР с последующим рестрикционным анализом и с использованием молекулярных зондов

Генотипирование стада

Провести генотипирование коров стада АО «Рассвет» и сформировать рекомендации по подбору оптимальных пар скрещивания для повышения продуктивности потомства.

Подбор пар Продуктивность Селекция

· Ход работы

Выделение ДНК из буккального эпителия и молока

Все образцы были отобраны и предоставлены сотрудниками АО «Рассвет» с разрешения локального биоэтического комитета.

Оценка концентрации ДНК

Проведение ПЦР выделенных образцов

Электрофорез в агарозном геле

ДНК

из эпителия и молока — два источника генетической информации

ПЦР

аллель-специфичный анализ маркерных генов продуктивности

Пары

обоснованный подбор родительских пар по генотипу

Методы
исследования

Выделение ДНК Нанодроп ПЦР с зондами ПЦР + рестрикция

Пять методов исследования

От подготовки образца до идентификации аллеля — каждый этап имеет значение. Нажмите «Подробнее», чтобы раскрыть протокол.

Выделение ДНК

Из буккального эпителия и молока. Спин‑колонки, щелочной лизис, магнитные частицы.

Измерение концентрации

Спектрофотометрия на NanoDrop: чистота и количество ДНК перед ПЦР.

ПЦР с зондами

Аллель‑специфичная ПЦР в реальном времени с флуоресцентными зондами TaqMan.

Аллель‑специфичная ПЦР

Классический формат с гель‑электрофорезом: разделение аллелей по длине ампликона.

ПЦР + рестрикция

ПЦР‑RFLP: аллель дифференцируется после расщепления эндонуклеазой рестрикции.

Выделение ДНК из буккального эпителия и молока

Три способа получить препарат ДНК, пригодный для ПЦР. Сравните протоколы и выберите свой.

Источники биоматериала

Буккальный эпителий — соскоб с внутренней поверхности щеки; быстро, неинвазивно, подходит для массового скрининга.
Молоко — соматические клетки и лейкоциты; удобно отбирать на ферме без фиксации животного.

Три подхода к выделению

Каждый метод отличается по скорости, выходу и чистоте ДНК. Мы использовали метод выделения на спин-колонках, на магнитных частица и ледяной лизис

Что важно на этапе пробоподготовки

Консервация. Образцы стабилизируют в специальных буферах или замораживают при −20 °С сразу после отбора.

Лизис. Разрушение клеточных мембран и ядер протеиназой К, щелочью или детергентами в составе буфера.

Очистка. Удаление белков, РНК и ингибиторов ПЦР (молочные жиры, соли, муцины).

Элюция. ДНК растворяют в низкосолевом буфере или деионизованной воде и хранят при −20 °С.

Измерение концентрации ДНК на NanoDrop

Спектрофотометрия в микрообъёме — 1 мкл образца и 5 секунд до результата.

Принцип метода

NanoDrop измеряет поглощение УФ‑света при длинах волн 260 нм (нуклеиновые кислоты), 280 нм (белки) и 230 нм (соли, фенол, углеводы). Концентрация ДНК рассчитывается по закону Бугера‑Ламберта‑Бера.

Ключевые показатели

A260/A280 ≈ 1,8–2,0 — чистая ДНК, без примеси белков.
A260/A230 ≈ 2,0–2,2 — отсутствие солей и органических загрязнений.
Концентрация в нг/мкл пересчитывается по коэффициенту 50 нг/мкл на 1 ед. A260 для дцДНК.

Протокол измерения

Blank. Нанесите 1 мкл буфера для элюции на пьедестал, обнулите прибор.

Образец. Промокните, нанесите 1 мкл исследуемой ДНК, опустите рычаг.

Измерение. Дождитесь автоматического построения спектра 220–350 нм.

Решение. Зафиксируйте концентрацию и соотношения A260/A280, A260/A230. Разведите до рабочей концентрации 50–100 нг/мкл для ПЦР.

Источник ДНК

Буккальный эпителий · Молоко

Два основных источника ДНК для наших исследований

Аллель‑специфичная ПЦР с зондами (TaqMan)

Детекция аллеля в реальном времени — высокая специфичность и минимум пост‑анализа.

Принцип метода

В реакцию добавляются два аллель‑специфичных олигонуклеотидных зонда, меченных разными флуорофорами (FAM, VIC/HEX). Каждый зонд комплементарен только «своему» аллелю. При отжиге только «правильный» зонд гибридизуется и расщепляется 5'‑экзонуклеазной активностью Taq‑полимеразы — флуорофор высвобождается и регистрируется прибором.

Преимущества

Два аллеля в одной пробирке — экономия реактивов и времени.
Не нужен гель‑электрофорез: результат сразу после амплификации.
Минимальный риск контаминации (пробирка не вскрывается).
Количественная и качественная оценка в одном цикле.

Температурный профиль

95°

Начальная денатурация — 3 мин. Активация Taq‑полимеразы.

95°

Денатурация — 15 с. Разделение цепей ДНК.

60°

Отжиг + элонгация — 30–60 с. Праймеры и зонды связываются, идёт синтез, детектор фиксирует флуоресценцию. 35–40 циклов.

Источник ДНК

Крупный рогатый скот

Объект генотипирования по генам продуктивности

Аллель‑специфичная ПЦР (классическая)

Разделение аллелей по длине ампликона и визуализация в агарозном геле.

Принцип метода

Для каждого аллеля используется отдельная пара праймеров. 3'‑конец одного из праймеров совпадает с вариабельной позицией — он «работает» только на «своём» аллеле. Продукты реакции различаются по длине и разделяются электрофорезом в агарозном геле.

Что нужно учитывать

Жёсткие условия отжига (60–65 °С) для подавления неспецифичного отжига.
Оптимизация Mg²⁺ и DMSO для GC‑богатых участков.
Контроли: положительный (известный генотип) и отрицательный (без ДНК).
Учёт инвертированных SNP: при A→G неспецифичный праймер может работать лучше «правильного».

Протокол

Подбор праймеров. Два аллель‑специфичных прямых праймера + один общий обратный. При необходимости — намеренное несовпадение во 2‑й позиции 3'‑конца.

Постановка ПЦР. 25 мкл смеси, 50–100 нг ДНК, 35 циклов, отжиг 60–65 °С.

Электрофорез. 2–3% агарозный гель, TAE/TBE буфер, 100 В, 30–40 мин.

Учёт. Гель окрашивают бромистым этидием или SYBR, фотографируют в трансиллюминаторе.

Источник ДНК

Генотип по 7 генам

AGPAT6 · CSN2 · CAPN316 · CSN3 · CSN1S1 · PRL · α‑LA

Аллель‑специфичная ПЦР с рестрикцией (ПЦР‑RFLP)

Когда SNP сам по себе не нарушает отжиг праймера, но создаёт или уничтожает сайт рестрикции.

Принцип метода

Сначала проводят стандартную ПЦР с праймерами, фланкирующими SNP. Затем ампликон обрабатывают эндонуклеазой рестрикции, которая узнаёт строго определённую последовательность. Если SNP входит в сайт узнавания — аллель разрезается, если нет — остаётся целым. Длина фрагментов оценивается электрофорезом.

Типичные ферменты

Hinf I — для CSN2 и других молочных генов.
Hae III — компактный сайт GG↓CC.
Msp I, Taq I, Bsp HI — частые гости в протоколах ПЦР‑RFLP.

Протокол

Дизайн праймеров. Ампликон 100–500 п.н., внутри — сайт рестрикции, перекрывающий SNP.

ПЦР. Стандартный протокол, очистка не требуется.

Рестрикция. 10–20 мкл ПЦР‑продукта + 1–2 ед. фермента, инкубация 1–3 ч при 37 °С (или иной температуре для конкретной эндонуклеазы).

Электрофорез. 2–3% агарозный или 8–12% ПААГ‑гель. Генотип определяется по паттерну полос.

Источник ДНК

Исследуемые гены

Семь ключевых генов, определяющих качество молока и мяса у крупного рогатого скота.

Гены	Рассматриваемый признак и влияние гена	Варианты гена
AGPAT6	Процентное содержание жира в молоке	Аллель C отвечает за максимальную жирность и плотность молока, а аллель T — за его наименьшую жирность.
CSN2	Гипоаллергенность молока, общая молочная продуктивность коров	Аллель A отвечает за повышенное производство молока, а аллель B связан с быстрым свертыванием молока (сыр).
CAPN316	Качество мясной продукции (нежность и сочность мяса)	Аллель C отвечает за повышение качества мясной продукции, а наличие аллеля G обуславливает жесткость мяса.
CSN3	Технологические свойства молока (сыропригодность, скорость коагуляции, плотность сгустка)	Аллель B обеспечивает высокое содержание белка в молоке, а аллель A отвечает за высокие объёмы общего удоя.
CSN1S1	Общий выход молока, содержание белков и жиров в нем	Главные аллели гена (A, B, C) обеспечивают максимальный выход сыра.
PRL	Молочная продуктивность и качество получаемого молока	Вариант гена C обеспечивает увеличение объёмов молока у КРС, а T связан с повышенной жирностью и белковомолочностью.
α‑LA	Общий объём удоя и повышение уровня белка и жира в молоке.	Аллель A обеспечивает максимальный выход молока, а аллель B отвечает за меньшее количество молока, увеличение его жирности.

В итоге, сведя вместе все успешно полученные результаты по разным методам, мы составили единую финальную таблицу и разделили наших коров на две полезные для хозяйства категории.

ГРУППА №1

Молочность

AGPAT6: C-максимальную жирность, плотность молока T- за его наименьшую жирность CSN3 B-высокое содержание белка в молоке A-высокий объём общего удоя CSN1S1 С,В- повышенная жирность и белковость молока PRL С-увеличение объёмов молока у КРС T-повышенная жирность, белковомолочность CSN2 А-повышенное производство молока В-связан с быстрым свертыванием молока (сыр) a-LA A- обеспечивает максимальный выход молока B- меньшее количество молока, увеличение его жирности GH1 C-максимальный удой D-высокое содержание жира и белка в молоке DGAT1 К-высокое содержание жира в молоке А-высокий удой B-LG А-высокий удой В-высокое содержание белка и жира

ГРУППА №2

Суррогатные матери (реципиенты)

src=</div

CSN1S1 С,В- повышенная жирность и белковость молока PRL С-увеличение объёмов молока у КРС T-повышенная жирность, белковомолочность CAPN530 А-отвечает за повышение качества мясной продукции G-обуславливает жесткость мяса a-LA A- обеспечивает максимальный выход молока B- меньшее количество молока, увеличение его жирности DGAT1 К-высокое содержание жира в молоке А-высокий удой B-LG А-высокий удой В-высокое содержание белка и жира

✓ Такой подход позволяет не выбраковывать скот, а найти правильное и экономически выгодное применение абсолютно каждому животному в хозяйстве.

Выделена ДНК из буккального эпителия и молока различными способами (на спин-колонках, на магнитных частицах, щелочным лизисом). Проведено сравнение разных методов выделения ДНК: щелочной лизис дает больший выход ДНК из молока; на магнитных частицах - из буккального эпителия. Однако в двух случаях щелочной лизис даёт более стабильный результат.

Оценили аллели хозяйственно-полезных признаков при помощи аллель-специфичной ПЦР, определили аллельное разнообразие генов коров.

Проведено генотипирование коров стада АО «Рассвет» и составление базы данных для подбора оптимальных пар скрещивания и повышения продуктивности стада.

Наши партнеры
ООО «Альтраген»
«Альтраген» предлагает инновационные методы воспроизводства высокоценных племенных животных, позволяющие значительно ускорить селекционный процесс, такие как трансплантация эмбрионов и клонирование

АО «Рассвет»
АО «Рассвет» находится в Усть‑Лабинском районе Краснодарского края. Предприятие входит в агрохолдинг «Прогресс Агро» и занимается растениеводством и молочным животноводством. В хозяйстве применяют инновации — в том числе генотипирование скота и переработку отходов.

Проектная команда