Сборка плазмид
Мы собрали плазмиду, у которой укорочены плечи гомологии гена LEU2. Это событие увеличивает шанс правильной встройки гена целевого белка в геном K. phaffii.
Встройка нескольких копий целевого гена в геном Komagataella phaffii:
разработка метода и оценка влияния на продукцию белка
разработка метода и оценка влияния на продукцию белка
Партнер нашего проекта
Актуальность
Проект участвует в развитии технологического суверенитета
Переход к высокопродуктивному и экологически чистому агрохозяйству
K. phaffii - это платформа для производства ферментов. Они нужны для повышения продуктивности кормов, удобрений, обработки с/х продукции и т.д.
Почему именно Komagataella phaffii?
Посттрансляционные модификации
Обеспечивает корректный фолдинг и правильное гликозилирование для точного созревания белка mCherry.
Высокая растворимость
Целевой красный флуоресцентный белок сохраняет стабильную растворимую форму без образования телец включения.
Низкий риск заражения
Безопасное производство благодаря отсутствию риска загрязнения чужеродными эндотоксинами.
Эффективная секреция
Прямая секреция белка в культурную среду, минимизирующая количество побочных продуктов очистки.
Высокая плотность колоний
Идеально подходит для высокопродуктивного культивирования ауксотрофного штамма и масштабирования.
Цель работы
Разработать способ получения штамма K. phaffii содержащего несколько копий гена mCherry на основе штамма ауксотрофного по лейцину.
Задачи проекта
- Получить плазмиды, несущие ген Leu2 c промотором длиной 60 п. н. и ген Leu2 из генома пекарских дрожжей с промотором длиной 30 п. н.
- Трансформировать K. phaffii полученными плазмидами.
- Измерить различия в эффективности наработки целевого белка в клонах с различным числом копий целевого гена.
Гипотеза
При трансформации K. phaffii модифицированными плазмидами с дефектным маркером Leu2 клоны будут жизнеспособны на минимальной среде.
Такие клоны будут продуцировать целевой белок mCherry при культивировании с метанолом.
Продукция mCherry такими клонами будет выше, чем клонами, трансформированными исходной плазмидой.
Наша исходная плазмида
Вырезаем из плазмиды ген Leu2 по сайтам Xba1 и Hpa1
Вшиваем в нашу плазмиду модифицированные гены Leu2
Трансформируем бактерии E.coli плазмидами для дальнейшей наработки
Трансформируем дрожжей плазмидами путем электропорации
Линеаризуем* плазмиды по сайту Sac1 для успешной встройки в геном
Результат: плазмиды встроились, дрожжи выделяют красный флоуресцентный белок mCherry
Мы отбираем* дрожжи, в которых прошло от трех и более плазмидых встроек в геном.
3 копии плазмиды в геноме ---> 3 гена целевого белка ---> в 3 раза выше эффективность штамма
3 копии плазмиды в геноме ---> 3 гена целевого белка ---> в 3 раза выше эффективность штамма
Ген Leu2 c промотором 60 п.н., с длинными плечами гомологии
Ген Leu2 из пекарских дрожжей длина промотора 30 п.н.
Итог : УСПЕХ
*отбор проходит на минимальной среде без лейцина, в синтезе которого участвует продукт гена Leu2.
На этой среде выживают только те штаммы, в которых более 3х копий гена Leu2, а значит и копий плазмиды, в которых содержится целевой белок.
На этой среде выживают только те штаммы, в которых более 3х копий гена Leu2, а значит и копий плазмиды, в которых содержится целевой белок.
Наш целевой ген
Селективный маркер
Линеаризованная плазмида с геном Leu2 из пекарских дрожжей и промотором с длинной промотора 30 п.н.
Линеаризованная плазмида с геном LEU2 и промотором с длинной промотора 60 п.н.
*Линеаризуем по сайту Sac1, который находится в области промотора гена AOX1.
Такой ген есть в геноме дрожжей.
Таким образом мы "обманываем" систему репарации дрожжей, система "думает", что это оторванный кусок генетического материал дрожжей и вставляет нашу линеаризованную плазмиду в геном.
Такой ген есть в геноме дрожжей.
Таким образом мы "обманываем" систему репарации дрожжей, система "думает", что это оторванный кусок генетического материал дрожжей и вставляет нашу линеаризованную плазмиду в геном.
Cхема эксперимента
Здесь надо вникнуть...
Трансформация Pichia pastoris
Управляйте клеткой дрожжей и ловите плазмиды для экспрессии красного белка mCherry! Осторожно: не перегрузите клетку!
Плазмид поглощено: 0
Штамм: Дикий тип (Wild Type)
Сборка плазмид
В данный период работы собирались и нарабатывались плазмиды с разными вариациями гена биосинтеза лейцина: ген leu2 с длиной промотора 60 п.н., ген leu2 с такой же длиной промотора, но с укороченными плечами гомологии, ген leu2 из S. cerevisiae с длинной промотора 30 п.н.
Подготовительные работы
На этом этапе работы происходила трансформация дрожжей получившимися плазмидами путем электропорации.
В эти дни мы занимались наработкой целевого белка mCherry, а также проводили измерения флюоресценции. По полученным данным сравнивали эффективность секреции белка различных штаммов.
Трансформация дрожжей
Наработка целевого белка
Дорожная карта проекта
4
5
1
2
3
1 - 5 июля
2 - 18 июля
11 - 16 июля
16 - 22 июля
С 20 по 24 июля мы занимались обработкой полученных данных, формулировали выводы, создавали сайт, плакат, а также участвовали в ярмарке проектов.
20 - 24 июля
В подготовительные работы входило приготовление сред для роста дрожжей и бактерий, культивирование дрожжей
Финальная обработка результатов
Результаты нашей работы
Наработка плазмид
Мы трансформировали бактерии E. coli нашими плазмидами для увеличения количества векторов и наработки достаточного объёма ДНК для следующего этапа.
Трансформация дрожжей
Мы трансформировали дрожжи K. phaffii наработанными плазмидами. Все полученные штаммы имели несколько встроек, из-за чего выход белка увеличился.
Собранная плазмида с длиной промотора гена leu 2
60 п.н. с укороченными плечами гомологии может быть использована в дальнейших исследованиях.
60 п.н. с укороченными плечами гомологии может быть использована в дальнейших исследованиях.
Трансформация K. phaffii плазмидой с
укороченным до 60 п н промотором гена leu 2
позволяет получить жизнеспособные колонии на
минимальной среде Эффективность такой
трансформации снижена в 500 раз по сравнению с
нативной плазмидой.
укороченным до 60 п н промотором гена leu 2
позволяет получить жизнеспособные колонии на
минимальной среде Эффективность такой
трансформации снижена в 500 раз по сравнению с
нативной плазмидой.
При трансформации K. phaffii плазмидой с укороченным до 60 п.н. промотором гена leu2 не все клоны продуцируют mCherry, это связано с нецелевой рекомбинацией по локусу leu2. Предполагается, что укорочение плеч гомологии снизит вероятность такой рекомбинации.
Выводы
Наша команда
Команда, которая усердно работала на протяжении 3 недель
- Адамонис ЕлизаветаРеспублика Крым
- Ганиева ВитаРеспублика Удмуртия
- Иванова АннаНижегородская область
- Сапрыкина Дарьяг. Москва
- Чернявский Павелг. Москва
- Щербак Александрг. Москва
Руководители команды
Те люди, которые задавали вектор проекта
- Иванов Артемий АлександровичПреподаватель
Аспирант ИЦиГ СО РАН - Дмитриева Анастасия МихайловнаПреподаватель
Аспирант ИЦиГ СО РАН - Азарова Виктория ВадимовнаСтажерПервый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России