Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) -метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков.Для этого проводят 20–30 циклов реакции. Каждый цикл состоит из трех этапов.
1. Денатурация
Чтобы полимераза могла работать, две цепи ДНК-матрицы нужно разъединить. Для этого реакционную смесь нагревают до 94–98 °С. В таких условиях разрушаются водородные связи между азотистыми основаниями параллельных цепей.
2. Отжиг праймеров
На этом этапе праймеры специфично присоединяются к освободившимся цепям ДНК-матрицы с разных сторон копируемого участка 3ˊ-концами друг к другу. Чтобы праймеры могли комплементарно связаться (отжечься) только с нужными участками, при их конструировании необходимо учитывать такую важную характеристику, как температура плавления (Тm). Это расчетная температура, при которой половина праймеров присоединяется к целевому участку ДНК. Отжиг проводят при температуре на 1–5 °С ниже Tm, но не выше оптимальной температуры работы полимеразы, то есть в пределах 40–72 °С.
3. Элонгация, или синтез ДНК
Этот этап чаще проводят при температуре 72 °С — оптимальной для работы Taq-полимеразы. Фермент присоединяется к комплексам праймер—матрица и, выхватывая из раствора нуклеотиды, начинает по принципу комплементарности прилаживать их к 3ˊ-концу праймера. Удлинение, или элонгация, новой цепи ДНК идет с максимальной скоростью 50–60 нуклеотидов в секунду (то есть около 3000 в минуту). Однако при программировании ПЦР-циклера задают время с запасом: по минуте на каждую тысячу пар нуклеотидов.
Каждая вновь синтезированная цепочка ДНК становится, наравне со старой, матрицей для синтеза в следующем цикле. Таким образом, количество нужного продукта в процессе реакции возрастает экспоненциально. После прохождения всех циклов в реакционной смеси образуется столько специфических двухцепочечных продуктов, что их «массив» можно увидеть невооруженным глазом — проведя гель-электрофорез. К сожалению, экспоненциальная амплификация не может длиться вечно. Через 25–30 циклов количество функциональных молекул полимеразы в реакционной смеси истощается. Но чтобы добиться еще большего выхода продукта, содержимое пробирки можно разбавить, например, в 1000 раз и снова использовать для амплификации с уже новыми рабочими компонентами.
1. Денатурация
Чтобы полимераза могла работать, две цепи ДНК-матрицы нужно разъединить. Для этого реакционную смесь нагревают до 94–98 °С. В таких условиях разрушаются водородные связи между азотистыми основаниями параллельных цепей.
2. Отжиг праймеров
На этом этапе праймеры специфично присоединяются к освободившимся цепям ДНК-матрицы с разных сторон копируемого участка 3ˊ-концами друг к другу. Чтобы праймеры могли комплементарно связаться (отжечься) только с нужными участками, при их конструировании необходимо учитывать такую важную характеристику, как температура плавления (Тm). Это расчетная температура, при которой половина праймеров присоединяется к целевому участку ДНК. Отжиг проводят при температуре на 1–5 °С ниже Tm, но не выше оптимальной температуры работы полимеразы, то есть в пределах 40–72 °С.
3. Элонгация, или синтез ДНК
Этот этап чаще проводят при температуре 72 °С — оптимальной для работы Taq-полимеразы. Фермент присоединяется к комплексам праймер—матрица и, выхватывая из раствора нуклеотиды, начинает по принципу комплементарности прилаживать их к 3ˊ-концу праймера. Удлинение, или элонгация, новой цепи ДНК идет с максимальной скоростью 50–60 нуклеотидов в секунду (то есть около 3000 в минуту). Однако при программировании ПЦР-циклера задают время с запасом: по минуте на каждую тысячу пар нуклеотидов.
Каждая вновь синтезированная цепочка ДНК становится, наравне со старой, матрицей для синтеза в следующем цикле. Таким образом, количество нужного продукта в процессе реакции возрастает экспоненциально. После прохождения всех циклов в реакционной смеси образуется столько специфических двухцепочечных продуктов, что их «массив» можно увидеть невооруженным глазом — проведя гель-электрофорез. К сожалению, экспоненциальная амплификация не может длиться вечно. Через 25–30 циклов количество функциональных молекул полимеразы в реакционной смеси истощается. Но чтобы добиться еще большего выхода продукта, содержимое пробирки можно разбавить, например, в 1000 раз и снова использовать для амплификации с уже новыми рабочими компонентами.
В нашей ПЦР мы использовали разные программы на различные праймеры.
