Электрофорез
Электрофореграммы продуктов амплификации SCAR-маркеров:
А. SCO04 (ген Radv), Б. SCX_20 (ген Radv), В. SCT06 (ген R1).
М – маркер молекулярного веса 1000 bp (Biolabmix)
А. SCO04 (ген Radv), Б. SCX_20 (ген Radv), В. SCT06 (ген R1).
М – маркер молекулярного веса 1000 bp (Biolabmix)
На рис. А мы видим два вида бэндов: бэнды наличия гена Radv у трёх дорожек (линии ВИР 2, ВИР 3 и ВИР 4) и отсутствия у других линий, на рис. Б и В - бэнды у четырёх дорожек, что указывает на наличие генов устойчивости к ржавчине. Мы проводили электрофорез, чтобы идентифицировать линии подсолнечника на наличие генов устойчивости к ржавчине.
Разделение смесей биомолекул в электрическом поле называется электрофорезом . Молекулы будут двигаться в сторону соответствующего полюса в поле постоянного тока, и скорость их движения будет зависеть как от степени их заряда, так и от их размера.
Если мы поместим смесь биомолекул в буферный раствор и приложим постоянное напряжение, молекулы сперва начнут делиться, а потом немедленно перемешаются благодаря конвекции — водный раствор будет выполнять функции резистора, полностью рассеивая всю приложенную энергию электрического тока в виде тепла. Для предотвращения конвекции и в качестве молекулярного сита обычно используют гели агарозы или полиакриламида. Гель напоминает по текстуре мармелад или студень — нужную полоску можно вырезать из геля, а молекулы из нее исследовать другими способами.
Подбирая концентрацию этих веществ, можно получать гели с заданной величиной пор, оптимизируя их для разделения тех или иных смесей. ДНК будет двигаться в поле постоянного тока от отрицательного полюса к положительному, и ее движение можно видеть в ультрафиолетовом свете — после добавления в гель особого красителя бромистого этидия, комплекс которого с ДНК флуоресцирует ярко-оранжевым светом. Отдельные компоненты смеси разделяются на полоски, содержащие популяцию молекул одной длины (бэнды).
После окончания ПЦР чтобы увидеть, намножились ли нужные участки ДНК, содержимое пробирок подвергают электрофорезу в агарозном геле с последующим окрашиванием — так молекулы ДНК разной длины разделяются пространственно и становятся видны невооруженным глазом. Полиакриламидный гель намного плотнее, поэтому больше подходит для разделения очень коротких фрагментов (несколько десятков пар нуклеотидов), при этом можно увидеть разницу даже в один нуклеотид!
Мы использовали 2% агарозный гель для гель электрофореза.
Если мы поместим смесь биомолекул в буферный раствор и приложим постоянное напряжение, молекулы сперва начнут делиться, а потом немедленно перемешаются благодаря конвекции — водный раствор будет выполнять функции резистора, полностью рассеивая всю приложенную энергию электрического тока в виде тепла. Для предотвращения конвекции и в качестве молекулярного сита обычно используют гели агарозы или полиакриламида. Гель напоминает по текстуре мармелад или студень — нужную полоску можно вырезать из геля, а молекулы из нее исследовать другими способами.
Подбирая концентрацию этих веществ, можно получать гели с заданной величиной пор, оптимизируя их для разделения тех или иных смесей. ДНК будет двигаться в поле постоянного тока от отрицательного полюса к положительному, и ее движение можно видеть в ультрафиолетовом свете — после добавления в гель особого красителя бромистого этидия, комплекс которого с ДНК флуоресцирует ярко-оранжевым светом. Отдельные компоненты смеси разделяются на полоски, содержащие популяцию молекул одной длины (бэнды).
После окончания ПЦР чтобы увидеть, намножились ли нужные участки ДНК, содержимое пробирок подвергают электрофорезу в агарозном геле с последующим окрашиванием — так молекулы ДНК разной длины разделяются пространственно и становятся видны невооруженным глазом. Полиакриламидный гель намного плотнее, поэтому больше подходит для разделения очень коротких фрагментов (несколько десятков пар нуклеотидов), при этом можно увидеть разницу даже в один нуклеотид!
Мы использовали 2% агарозный гель для гель электрофореза.
Электрофореграммы продуктов амплификации SCAR-маркеров:
А. RORs1+SORs9 (ген HaOr7), Б. RORs1 (ген HaOr7), В. SORs9 (ген HaOr7).
М – маркер молекулярного веса 1000 bp (Biolabmix)
А. RORs1+SORs9 (ген HaOr7), Б. RORs1 (ген HaOr7), В. SORs9 (ген HaOr7).
М – маркер молекулярного веса 1000 bp (Biolabmix)
Мы проводили электрофорез с использованием продуктов как мультиплексной ПЦР, так и ПЦР с отдельными маркерами. На рис. Б не видно бэндов, которые могли бы показать наличие гена HaOr7. На рис. В показано то, что все линии восприимчивы к заразихе.
Электрофореграммы продуктов амплификации CAPS-маркерa:
А. G-D1 (ген HaDella1), Б. рестрикционный анализ с рестриктазой NheI (Thermo Scientific)
М – маркер молекулярного веса 1000 bp (Biolabmix)
А. G-D1 (ген HaDella1), Б. рестрикционный анализ с рестриктазой NheI (Thermo Scientific)
М – маркер молекулярного веса 1000 bp (Biolabmix)
На рис. А мы можем увидеть на всех дорожках, кроме отрицательного контроля, бэнды длиной в 675 п.н. Это означает, что ПЦР с праймером G-D1 прошла. Измерив концентрацию ампликонов, был поставлен рестрикционный анализ на идентификацию аллель-специфичного SNP в 143 паре нуклеотидов.
Линия ВИР 1
Линия ВИР 1
- У всех линий подсолнечника, кроме ВИР 5, есть гены устойчивости к ржавчине. ВИР 1 имеет ген Radv (маркер SCX 20), ВИР 2 - гены Radv (маркер SCO04) и R1 (маркер SCT06), линии ВИР 3 и ВИР 4 - все три гена, а ВИР 6 - гены Radv (маркер SCX 20) и R1.
- Все линии восприимчивы к заразихе (нет генов устойчивости к ней).
- Только одна линия (ВИР 6) является высокорослой, а остальные - карликовые линии.
- Рестрикционный анализ 6 линий коллекции ВИР на SNP мутацию в белке DELLA, влияющию на рост растение, показал:
- в линии ВИР 2, мутация в белке DELLA, предполагаемый фенотип карлик
- в линиях ВИР 1, ВИР 3, ВИР 4, ВИР 5, мутация в белке DELLA, но гетерозигота, предполагаемый фенотип карлик
Выводы