образовательный центр "сириус"
Разработка системы идентификации происхождения икры лососевых рыб на основе митохондриальной ДНК​
Лососевые Лососевые Лососевые Лососевые Лососевые Лососевые Лососевые
Партнеры
Лососёвые — семейство лучеперых рыб из отряда лососеобразных, которые широко распространены на территории России, а также активно используются в аквакультуре для производства красной икры, которая считается одним из самых востребованных деликатесов.
Однако браконьерство, чрезмерный вылов и ухудшение экологической обстановки в регионах сильно влияет на естественные популяции лососевых, из-за чего некоторые популяции лососевых уже входят в Красную книгу и нуждаются в защите.

Метод секвенирования по Сэнгеру
Отсутствие прямых аналогов для лососевых рыб
Уникальность
Универсальность
Инструмент для фундаментальных и экологических исследований, а также биомониторинга
Точность
Точная и универсальная идентификация происхождения икры лососевых рыб
Актуальность
Возможность использования метода при ловле браконьеров и идентификации икры
План работы
1
1
Оптимизация выделения ДНК
2
2
Подбор вырожденных праймеров​
3
3
Проверка праймеров​
4
4
Очистка ПЦР продукта​
5
5
Секвенирование
6
6
Сравнение последовательностей с базой данных​
7
7
Построение филогенетических
деревьев​
Объекты
Род Salmo (Настоящие лососи): Семга​

Род Salvelinus (Гольцы): Арктический голец​

Род Oncorhynchus (Тихоокеанский лосось): Кижуч, Нерка, Амурская кета, Форель радужная, Горбуша​

Род Brachymystax (Ленки): Ленок ​

Род Coregonus (Сиги): Сиг обыкновенный, Пелядь, Муксун, Чир​

Род Thymallus (Хариусы): Амурский хариус​

Род Stenodus (Белорыбица/нельма): Нельма​
Спектрофотометрия выделенной ДНК​
Подбор условий выделения ДНК​
Подбор праймеров
1. NCBI
Поиск последовательности в базе данных

2. UGENE и MUSCLE
Выравнивание и получение консенсусной последовательности


3. Gene Runner
Подбор праймера

Гель-электрофорез
Анализ гель-электрофореза показал, что праймеры работают корректно на всем спектре представленных видов
При помощи выбранных нами праймеров и оптимизации температуры отжига мы провели ПЦР выделенной нами ДНК различных лососёвых
ПЦР
Постановка секвенирования и обработка полученных сырых данных
Секвенирование
1
2
3
Секвенирование
Филогенетические деревья
Выводы
1
2
3
Выделение ДНК из икры менее эффективно в сравнении с выделением из других биологических материалов. Оптимизированный нами протокол, позволяющий увеличить выход ДНК, включает использование колонок Thermo Fisher, более длительную инкубацию в лизирующем буфере, а также повышенную концентрацию протеиназы K. ​

Система вырожденных праймеров, разработанная на три участка мтДНК - CytB, COX1 и D-петли, корректно работает на широком спектре лососеобразных.​


Посредством метода секвенирования по Сэнгеру участков CytB, COX1 и D-петли и последующего биоинформатического анализа может быть успешно определена видовая принадлежность образцов лососеобразных. ​
Среди лососеобразных наблюдается высокая вариабельность поли-Т-тракта в центральной части контрольного района, вызывающая гетероплазмию.​

4

Успехи применения системы

1
2
3
Фундаментальные аспекты:​
  • Были успешно реконструированы филогенетические взаимоотношения между 14 исследуемыми видами​
  • Были найдены новые гаплотипы, отсутствующие в базах данных.​



Практические рекомендации:​
  • Праймеры для секвенирования D-петли, не должны включать фрагмент, фланкирующий поли-Т-тракт.​
Прикладные аспекты:​
  • Сравнение полученных последовательностей с базой данных позволило выявить фальсифицированную продукцию красной икры, приобретенной в магазине.​
Coregonus ussuriensis​

Tilda Publishing
Одним из успехов нашей системы является обнаружение нового гаплотипа, который мы депонировали в базу данных NCBI.

Участники
Боровлева Полина
Орел
tg: @Polinaborovleva
Воронина Анна
Новосибирск
tg: @Selderey11
Кожина София
Москва
tg: @fsoxny
Царева Ольга
Москва
tg: @o_panty
Шапилов Кирилл
Санкт-Петербург
tg: @Kshapilov06

Янина Анастасия
Орел
tg: @na0styuha
Руководители
Трифонов Владимир Александрович
Доктор биологических наук,
профессор РАН, заведующий лабораторией Сравнительной геномики ИМКБ СО РАН
Новосибирск
Vlad@mcb.nsc.ru
Уткин Ярослав Александрович
Старший лаборант-исследователь ​лаборатории Сравнительной геномики ИМКБ СО РАН
Новосибирск
utkin.jaroslav@mcb.nsc.ru

Направление "Агропромышленные биотехнологии"
© Большие Вызовы, 2022