Также мы провели тест на анализ специфического связывания антител на популяции PBMC. Данный тест направлен на оценку способности наработанных антител специфически связываться с TRBV9+ Т-клетками в популяции PBMC. Для проведения этого теста мы инкубировали PBMC с наработанными антителами. После чего смесь дополнительно инкубировали с флуоресцентными антителами специфичными к маркерам различных Т-клеток и Fc-фрагментам человеческих антител. Популяция клеток, представленная в виде точечного графика, была гейтирована сначала по боковому и прямому светорассеянию (для отбора лимфоцитов), далее по PI(для отбора живых клеток), а затем по антителам к рецепторам CD3, CD4, CD8. Результаты визуализации подтверждают литературные данные по относительной частоте представленности TRBV9+ клеток. Таким образом, мы можем сделать вывод, что наши aTRBV9 антитела можно использовать для таргетного воздействия на патогенные TRBV9+ клоны при болезни Бехтерева без связывания с другими Т-клетками.

Следующим тестом, который мы провели был репортерный клеточный тест на ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность)
Он представляет собой модель для визуализации механизм работы антитела в организме. В качестве клетки-мишени выступает инженерная линия СНО с рецептором TRBV9 на поверхности. Клеткой-эффектором (репортерная линия) является модифицированная линия Jurkat-CD16-NFAT-Luc. Мы раститровали антитела на планшете и в каждую лунку добавили обе культуры клеток. Происходило связывание TRBV9 антител с рецептором на поверхности клеток СНО, затем связывание Fc части с рецептором СD16 и запуск каскада реакций, приводящих к синтезу люциферазы. С помощью люминометра мы измерили уровень люминесценции и по результатам построили график зависимости интенсивности свечения (те количества образовавшихся таких комплексов). Мы получили S-образные кривые для двух препаратов, нашли EC50, по которому видно, что 3 препарат активнее 4. Снизу показан отрицательный контроль с добавлением антител к Jurkat (в отсутствие клеток мишеней).

Еще одним проведенным тестом является тест на деплецию TRBV9+ клеток. Для него мы использовали клетки культуры PBMC. При добавлении к ним полученных антител, происходит их связывание с TRBV9+ клетками и NK клетками, что приводит к запуску механизма ADCC и уничтожению TRBV9+ клеток. Для начала, мы качественно оценили функциональную активность антитела по способности деплецировать CD3+ TRBV9+ популяцию клеток в PBMC здорового донора. Для проведения теста, мы взяли максимальную концентрацию антитела с верхнего плато, определенного раннее в репортерном тесте. Для оценки результата использовался метод проточной цитомерии, позволяющий количественно оценить уровень флуоресценции. Результаты представлены в виде столбчатой диаграммы, по ним видно, что деплеция целевой популяции клеток действительно происходит. Далее мы исследовали способность полученного антитела деплецировать клетки разных доноров и в меньших концентрациях.
Популяция клеток, представленная в виде точечного графика, была гейтирована сначала по боковому и прямому светорассеянию (для отбора лимфоцитов), затем по антителу к рецептору CD3. Из графика видно, что при увеличении концентрации препарата количество TRBV9+ клеток уменьшается почти до 0, что говорит о хорошей функциональности полученного антитела.