Потенциальные агенты для генетической терапии и диагностики
Антисенс-олигонуклеотиды в борьбе с Sars-Cov-2
 
Короткие фрагменты нуклеиновых кислот - олигонуклеотиды - комплементарные специфическим участкам последовательности РНК, используются как инструменты антисенс технологии. Цель этого подхода -подавить экспрессию специфического белка, остановив процесс трансляции или, напротив, запустить альтернативный сплайсинг. В настоящее время уже утвержден ряд некоторых лекарств на основе олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот.
Цель:
Создание ген-направленных соединений и исследование их связывания с РНК-мишенью методом задержки в геле
РНК мишень
Фрагмент РНК гена, кодирующего N-белок коронавируса, с 11 по 85 нуклеотид (74нт)

5'-GACCCCAAAAUCAGCGAAAUGCACCCCGCAUUACGUUUGGUGGACCC-UCAGAUUCAACUGGCAGUAACCAGAAU-3’

Нуклеокапсидный белок (N-белок) - структурообразующий белок, который связывается с вирусной геномной РНК и защищает ее от деградации, а также участвует в упаковке РНК в вирусные частицы. Рассматривается в настоящее время как мишень для противовирусной терапии, а также его РНК используется как диагностическая мишень.

Центральная догма молекулярной биологии
Выбранные флуорофоры и их внедрение
Флуоресцеин
Цианиновый 3
Метод активированных эфиров
Метод клик-химии
Выделение и анализ ON с флуоресцентными метками
Этапы работы:
1. Внедрение флуоресцентных меток в олигонуклеотиды
2. Аналитический электрофорез
3. Препаративный (денатурирующий) электрофорез
4. Аналитического электрофореза, (с целью подтверждения связывания меток с олигонуклеотидами)
5. Спектрофотометрия, измерение оптических единиц, с помощью которых, мы рассчитали концентрацию олигонуклеотидов в растворах
6. Приготовиление раствороа (олигонуклеотидов) с концентрацией 1*10^-5
7. Отслеживание эффективности образования комплексов, в зависимости от изменения соотношения РНК и олигонуклеотидов

Спектрофотометрия
Результаты расчетов константы диссоциации (Кд)
Выводы:
1.
Синтезированно 18 флуоресценто-меченых олигонуклеотидов с использованием двух типов флуоресцентных красителей и двух различных методов синтеза
2.
Подтверждено введение флуоресцентного красителя методами ГЭ и спектрометрии
3.
Проведено сравнение данных с расчетной Тм и для большинства конъюгатов выявлена корреляция между температурой плавления и константой диссоциации
4.
Экспериментально определена величина Кд для всех олигонуклеотидов и показано отсутствие влияния типа флуорофора и способа его введения на Кд
5.
Выявлено увелечение Кд для олигонуклеотидов с нуклеотидными несоответствиями
Наша команда:
  • «Охана — значит семья, в семье не бросят и никого никогда не забудут…»
к.х.н Новопашина Дарья Сергеевна
Научный руководитель



к.х.н Мещанинова Мария Ивановна
Научный руководитель
Аспирант Данилин Николай Александрович
Научный руководитель
Богорубов Максим
участник
Доценко Нина
участник
Кондратович Эвелина
участник
Матвеев Данила
участник
Никитин Семён
участник
Прохоров Роман
участник