Потенциальные агенты для генетической терапии и диагностики
Антисенс-олигонуклеотиды в борьбе с Sars-Cov-2
 
ИХБФМ СО РАН
Короткие фрагменты нуклеиновых кислот - олигонуклеотиды - комплементарные специфическим участкам последовательности РНК, используются как инструменты антисенс технологии. Цель этого подхода -подавить экспрессию специфического белка, остановив процесс трансляции или, напротив, запустить альтернативный сплайсинг. В настоящее время уже утвержден ряд некоторых лекарств на основе олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот.
Цель:
Создание ген-направленных соединений и исследование их связывания с РНК-мишенью методом задержки в геле
  • Задача 1
    Выбор РНК-мишени
  • Задача 2
    Введение флуоресцентных меток в комплементарные РНК-мишеням антисенс-олигонуклеотиды
  • Задача 3
    Исследование стабильности комплексов РНК с антисенс олигонуклеотидами методом задержки в геле с детекцией по флуоресценции; исследование влияния мутаций на стабильность комплексов
  • Задача 4
    Анализ полученных данных с использованием программ, позволяющих
    рассчитать константу диссоциации комплексов
  • Задача 5
    Теоретический расчёт термической стабильности комплексов ген-
    направленных соединений с РНК-мишенями
  • Задача 6
    Сравнение теоретических и экспериментальных данных по стабильности. Выработка рекомендаций по усовершенствованию ген-
    направленных соединений
РНК мишень
Фрагмент РНК гена, кодирующего N-белок коронавируса, с 11 по 85 нуклеотид (74нт)

5'-GACCCCAAAAUCAGCGAAAUGCACCCCGCAUUACGUUUGGUGGACCC-UCAGAUUCAACUGGCAGUAACCAGAAU-3’

Нуклеокапсидный белок (N-белок) - структурообразующий белок, который связывается с вирусной геномной РНК и защищает ее от деградации, а также участвует в упаковке РНК в вирусные частицы. Рассматривается в настоящее время как мишень для противовирусной терапии, а также его РНК используется как диагностическая мишень.

Центральная догма молекулярной биологии
Выбранные флуорофоры и их внедрение
  • Флуоресцеин
  • Цианиновый 3
  • Метод активированных эфиров
  • Метод клик-химии
Выделение и анализ ON с флуоресцентными метками
Этапы работы:
1. Внедрение флуоресцентных меток в олигонуклеотиды
2. Аналитический электрофорез
3. Препаративный (денатурирующий) электрофорез
4. Аналитического электрофореза, (с целью подтверждения связывания меток с олигонуклеотидами)
5. Спектрофотометрия, измерение оптических единиц, с помощью которых, мы рассчитали концентрацию олигонуклеотидов в растворах
6. Приготовиление раствороа (олигонуклеотидов) с концентрацией 1*10^-5
7. Отслеживание эффективности образования комплексов, в зависимости от изменения соотношения РНК и олигонуклеотидов

Спектрофотометрия
Результаты расчетов константы диссоциации (Кд)
Выводы:
  • 1.
    Синтезированно 18 флуоресценто-меченых олигонуклеотидов с использованием двух типов флуоресцентных красителей и двух различных методов синтеза
  • 2.
    Подтверждено введение флуоресцентного красителя методами ГЭ и спектрометрии
  • 3.
    Проведено сравнение данных с расчетной Тм и для большинства конъюгатов выявлена корреляция между температурой плавления и константой диссоциации
  • 4.
    Экспериментально определена величина Кд для всех олигонуклеотидов и показано отсутствие влияния типа флуорофора и способа его введения на Кд
  • 5.
    Выявлено увелечение Кд для олигонуклеотидов с нуклеотидными несоответствиями
Наша команда:
  • «Охана — значит семья, в семье не бросят и никого никогда не забудут…»
  • к.х.н Новопашина Дарья Сергеевна
    Научный руководитель



  • к.х.н Мещанинова Мария Ивановна
    Научный руководитель
  • Аспирант Данилин Николай Александрович
    Научный руководитель
  • Богорубов Максим
    участник
  • Доценко Нина
    участник
  • Кондратович Эвелина
    участник
  • Матвеев Данила
    участник
  • Никитин Семён
    участник
  • Прохоров Роман
    участник