Проверить на практике возможности эффективного использования систем 2А при создании вакцинных и других биотехнологических препаратов.
Задачи проекта:1. Провести молекулярное клонирование генетических конструкций, кодирующих рецептор-связывающий домен (RBD) белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, связанный с последовательностью флуоресцентных белков, между которыми расположен саморасщепляющийся пептид 2А.
2. Выделить и верифицировать плазмидные вектора с целевыми конструкциями.
3. Провести трансфекцию клеток СНО и визуализировать наличие репортерных белков с помощью флюоресцентной микроскопии.
4. Оценить эффективность функционирования 2А-системы с помощью флуоресцентной микроскопии и вестерн-блоттинга.
Создание вакцин против SARS-CoV-2 является одной из наиболее приоритетных задач мировой биотехнологической индустрии.
По статистике ВОЗ, мировая заболеваемость коронавирусом продолжает расти, в связи чем требуются меры по массовой иммунизации населения. За 2020 и 2021 года в базе данных NCBI PubMed опубликовано как минимум 146000 научных статей, так или иначе связанных с изучением вируса SARS-CoV-2 и вызываемого им заболевания COVID-19. При этом данных о функционировании 2А-систем при использовании вируса гриппа в качестве вектора практически нет (при подготовке проекта удалось найти лишь две публикации на отдаленно связанные темы за 2017 и 2018 года).
Первичная гипотеза полностью подтверждена не была, вместо неё был выдвинут ряд новых рабочих гипотез:
1. Сайт Р2А в данном пептидном окружении в клетках CHO не расщепляется;
2. Сайт Р2А расщепляется, но влияет на работу сигнального пептида GFP, связанного с целевым белком RBD;
3. Система P2A работает, но концентрация GFP+RBD в культуральной жидкости слишком мала, и флуоресценция GFP незаметна (необходимо проверка другим методом);
4. Клетки СНО (яичников китайского хомячка) не подходят для данного эксперимента.
Все рабочие гипотезы были успешно проверены, гипотеза №3 оказалась верной (по данным вестерн-блоттинга с антителами к белку RBD)
трансфекции
2. Выбранные сигнальные пептиды функционируют нормально и выводят GFP, связанный с RBD, на путь секреции.
3. Разница между эффективностью сигнальных пептидов mIgK и tPA незаметна.
4. Выбранные трансмембранные домены не задерживают RBD на мембране в выбранной системе экспрессии (клетки CHO).
2. Подобрать клетки (человеческие вместо CHO)
3. Увеличить выборку
- Дарья Кобзарь
Даша Пономарева
- Гандзюк Валентина
- Игорь Кисарин
- Юлия Ступко
- Юлия Папонова
- Кирилл Пичугин
- Нисканен Сергей
- Шеуджен Тимур
- Цветкова Анжела