Оптимизация экспрессии антигенных кассет при разработке вакцин против SARS-CoV-2
ГЕНЕТИКА, ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ И ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА

Цель и задачи проекта
Цель:

Проверить на практике возможности эффективного использования систем 2А при создании вакцинных и других биотехнологических препаратов.

Задачи проекта:

1. Провести молекулярное клонирование генетических конструкций, кодирующих рецептор-связывающий домен (RBD) белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, связанный с последовательностью флуоресцентных белков, между которыми расположен саморасщепляющийся пептид 2А.

2. Выделить и верифицировать плазмидные вектора с целевыми конструкциями.

3. Провести трансфекцию клеток СНО и визуализировать наличие репортерных белков с помощью флюоресцентной микроскопии.

4. Оценить эффективность функционирования 2А-системы с помощью флуоресцентной микроскопии и вестерн-блоттинга.


Проблема и актуальность

Создание вакцин против SARS-CoV-2 является одной из наиболее приоритетных задач мировой биотехнологической индустрии.

По статистике ВОЗ, мировая заболеваемость коронавирусом продолжает расти, в связи чем требуются меры по массовой иммунизации населения. За 2020 и 2021 года в базе данных NCBI PubMed опубликовано как минимум 146000 научных статей, так или иначе связанных с изучением вируса SARS-CoV-2 и вызываемого им заболевания COVID-19. При этом данных о функционировании 2А-систем при использовании вируса гриппа в качестве вектора практически нет (при подготовке проекта удалось найти лишь две публикации на отдаленно связанные темы за 2017 и 2018 года).


Гипотеза

Проверка гипотезы
Проверка гипотезы

Первичная гипотеза полностью подтверждена не была, вместо неё был выдвинут ряд новых рабочих гипотез:
1. Сайт Р2А в данном пептидном окружении в клетках CHO не расщепляется;
2. Сайт Р2А расщепляется, но влияет на работу сигнального пептида GFP, связанного с целевым белком RBD;
3. Система P2A работает, но концентрация GFP+RBD в культуральной жидкости слишком мала, и флуоресценция GFP незаметна (необходимо проверка другим методом);
4. Клетки СНО (яичников китайского хомячка) не подходят для данного эксперимента.
Все рабочие гипотезы были успешно проверены, гипотеза №3 оказалась верной (по данным вестерн-блоттинга с антителами к белку RBD)



Ход работы
Эффективность
трансфекции
Результаты
1. Система P2A при использовании в векторах на основе вируса гриппа функционирует с близкой к 100% эффективностью.
2. Выбранные сигнальные пептиды функционируют нормально и выводят GFP, связанный с RBD, на путь секреции.
3. Разница между эффективностью сигнальных пептидов mIgK и tPA незаметна.
4. Выбранные трансмембранные домены не задерживают RBD на мембране в выбранной системе экспрессии (клетки CHO).
Перспективы развития проекта
1. Подобрать трансмембранный домен
2. Подобрать клетки (человеческие вместо CHO)
3. Увеличить выборку

Наша команда
Дарья Кобзарь

Даша Пономарева

Гандзюк Валентина
Игорь Кисарин
Юлия Ступко
Юлия Папонова
Кирилл Пичугин

Наставники
Нисканен Сергей
Шеуджен Тимур
Цветкова Анжела