ahmedmamey11@gmail.com
Контакты
Разработка клеточной модели спинальной мышечной атрофии
Генетика, персонализированная и прогностическая медицина
ПАРТНЁРЫ
"Наука - поле свободного творчества. Она не признаёт границ и иерархий. Не сковывайте себя и свою мысль." - Мадера Дмитрий
Введение
Спинальная мышечная атрофия (далее СМА) является самой распространённой генетической причиной смертности младенцев во всём мире. Это заболевание является аутосомно-рецессивным. Каждый 36-ой человек в России является носителем СМА. Болеет каждый 6-10 тысячный человек. Заболевание связано с мутацией в гене SMN1 (survival motor neuron 1), вызывающей полное отключение экспрессии гена. Белок, кодируемый SMN1, называется SMN.
ЦЕЛЬ
  • Разработать клеточную модель для быстрого скрининга препаратов от спинальной мышечной атрофии.
  • Задача №1
    Провести пассаж клеточной линии U-87 MG
  • Задача №2
    Провести нокдаун гена SMN1
  • Задача №3

    Провести первичный скрининг двух вариантов препарата.​

ГИПОТЕЗА
Мы предполагаем, что оба препарата восстановят экспрессию SMN1 и по результатам ПЦР и ИФА определится наилучший кандидат.
Этапы работы
1
Культивирование клеток
В наших исследованиях была использована клеточная линия U-87-MG глиобластомы человека
2
Трансфекция
Для воспроизведения клеточной модели нам было необходимо провести нокдаун гена, а именно временно подавить его экспрессию. Трансфекцию проводили методом липофекции с помощью реагента "Липофектамин 3000". Само подавление осуществляла малая интерферирующая РНК.
3
Трансдукция
Для восстановления экспрессии гена вводили аденоассоциированный вирус с модифицированным 9-ым серотипом. В геноме вируса были заменены гены, ответственные за патогенез и репликацию вируса, на функциональный ген SMN1
4
Проточная цитометрия
Для проверки эффективности доставки препарата в клетку использовали метод проточной цитометрии, позволяющий идентифицировать клетки по интенсивности их флюоресценции
5
Метод BCA
Для определения экспрессии белка на основе нашего препарата прежде всего было необходимо лизировать клетки, выделить из них общий белок и выровнять его концентрацию во всех лунках планшета для корректного подсчёта.
6
ИФА (Иммуно-ферментный анализ) 
Чтобы непосредственно определить количество белка SMN проводили ИФА "сэндвич" методом.
7
Выделение РНК на колонках
Для получения более точных результатов проводили анализ количества мРНК SMN1 в клетках. Принцип метода основан на свойстве нуклеиновых кислот адгезироваться на силикагельной мембране в присутствии хаотропных ионов. В 2 мл пробирку без крышки вставляют колонку, к концу которой прикреплена силикагельная мембрана. При добавлении лизированных образцов на мембрану оседают только молекулы РНК, а все остальное осаждается на дне пробирки.
8
ПЦР (Полимеразная цепная реакция)
Количество РНК определяли методом ОТ-кПЦР (количественная ПЦР в реальном времени), основанной на многократной амплификации участка ДНК.

Результаты проекта в графиках

Выводы
  • 1
    Вывод №1
    siRNA к SMN1 ингибирует экспрессию гена как
    на уровне мРНК,
    так и на уровне белка.​
  • 2
    Вывод №2
    Оба препарата восстанавливают
    экспрессию гена на белковом уровне.
  • 3
    Вывод №3
    Существует тенденция к тому,
    что первый кандидат восстанавливает
    экспрессию белка эффективнее, чем второй
  • 4
    Вывод №4
    Различия в уровне восстановления уровня белка
    объясняются различием эффективности транскрипции.​
КОМАНДА
  • Мамий Ахмед
  • Первой Константин
  • Каушлиева Мария
  • Манакова Екатерина
  • Плотникова Ольга
  • Гоголева Дарья
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ
  • Мадера Дмитрий
  • Перекуча Наталья
  • Цветкова Анжела
  • Шеуджен Тимур
Направление "Генетика, персонализированная и прогностическая медицина"
©Большие Вызовы - 2021
Phone: +79627644016
Email: ahmedmamey11@gmail.com