Разработка клеточной модели спинальной мышечной атрофии
Генетика, персонализированная и прогностическая медицина
ПАРТНЁРЫ
"Наука - поле свободного творчества. Она не признаёт границ и иерархий. Не сковывайте себя и свою мысль." - Мадера Дмитрий
Введение
Спинальная мышечная атрофия (далее СМА) является самой распространённой генетической причиной смертности младенцев во всём мире. Это заболевание является аутосомно-рецессивным. Каждый 36-ой человек в России является носителем СМА. Болеет каждый 6-10 тысячный человек. Заболевание связано с мутацией в гене SMN1 (survival motor neuron 1), вызывающей полное отключение экспрессии гена. Белок, кодируемый SMN1, называется SMN.
ЦЕЛЬ
Разработать клеточную модель для быстрого скрининга препаратов от спинальной мышечной атрофии.
Задача №1
Провести пассаж клеточной линии U-87 MG
Задача №2
Провести нокдаун гена SMN1
Задача №3
Провести первичный скрининг двух вариантов препарата.
ГИПОТЕЗА
Мы предполагаем, что оба препарата восстановят экспрессию SMN1 и по результатам ПЦР и ИФА определится наилучший кандидат.
Этапы работы
1
Культивирование клеток
В наших исследованиях была использована клеточная линия U-87-MG глиобластомы человека
2
Трансфекция
Для воспроизведения клеточной модели нам было необходимо провести нокдаун гена, а именно временно подавить его экспрессию. Трансфекцию проводили методом липофекции с помощью реагента "Липофектамин 3000". Само подавление осуществляла малая интерферирующая РНК.
3
Трансдукция
Для восстановления экспрессии гена вводили аденоассоциированный вирус с модифицированным 9-ым серотипом. В геноме вируса были заменены гены, ответственные за патогенез и репликацию вируса, на функциональный ген SMN1
4
Проточная цитометрия
Для проверки эффективности доставки препарата в клетку использовали метод проточной цитометрии, позволяющий идентифицировать клетки по интенсивности их флюоресценции
5
Метод BCA
Для определения экспрессии белка на основе нашего препарата прежде всего было необходимо лизировать клетки, выделить из них общий белок и выровнять его концентрацию во всех лунках планшета для корректного подсчёта.
6
ИФА (Иммуно-ферментный анализ)
Чтобы непосредственно определить количество белка SMN проводили ИФА "сэндвич" методом.
7
Выделение РНК на колонках
Для получения более точных результатов проводили анализ количества мРНК SMN1 в клетках. Принцип метода основан на свойстве нуклеиновых кислот адгезироваться на силикагельной мембране в присутствии хаотропных ионов. В 2 мл пробирку без крышки вставляют колонку, к концу которой прикреплена силикагельная мембрана. При добавлении лизированных образцов на мембрану оседают только молекулы РНК, а все остальное осаждается на дне пробирки.
8
ПЦР (Полимеразная цепная реакция)
Количество РНК определяли методом ОТ-кПЦР (количественная ПЦР в реальном времени), основанной на многократной амплификации участка ДНК.
Результаты проекта в графиках
Выводы
1
Вывод №1
siRNA к SMN1 ингибирует экспрессию гена как на уровне мРНК, так и на уровне белка.
2
Вывод №2
Оба препарата восстанавливают экспрессию гена на белковом уровне.
3
Вывод №3
Существует тенденция к тому, что первый кандидат восстанавливает экспрессию белка эффективнее, чем второй
4
Вывод №4
Различия в уровне восстановления уровня белка объясняются различием эффективности транскрипции.
КОМАНДА
Мамий Ахмед
Первой Константин
Каушлиева Мария
Манакова Екатерина
Плотникова Ольга
Гоголева Дарья
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ
Мадера Дмитрий
Перекуча Наталья
Цветкова Анжела
Шеуджен Тимур
Направление "Генетика, персонализированная и прогностическая медицина"