Разработка клеточной модели спинальной мышечной атрофии
Генетика, персонализированная и прогностическая медицина
ПАРТНЁРЫ
"Наука - поле свободного творчества. Она не признаёт границ и иерархий. Не сковывайте себя и свою мысль." - Мадера Дмитрий

Введение
Спинальная мышечная атрофия (далее СМА) является самой распространённой генетической причиной смертности младенцев во всём мире. Это заболевание является аутосомно-рецессивным. Каждый 36-ой человек в России является носителем СМА. Болеет каждый 6-10 тысячный человек. Заболевание связано с мутацией в гене SMN1 (survival motor neuron 1), вызывающей полное отключение экспрессии гена. Белок, кодируемый SMN1, называется SMN.

ЦЕЛЬ
  • Разработать клеточную модель для быстрого скрининга препаратов от спинальной мышечной атрофии.
Задача №1
Провести пассаж клеточной линии U-87 MG
Задача №2
Провести нокдаун гена SMN1
Задача №3

Провести первичный скрининг двух вариантов препарата.​


ГИПОТЕЗА
Мы предполагаем, что оба препарата восстановят экспрессию SMN1 и по результатам ПЦР и ИФА определится наилучший кандидат.

Этапы работы
1
Культивирование клеток
В наших исследованиях была использована клеточная линия U-87-MG глиобластомы человека
2
Трансфекция
Для воспроизведения клеточной модели нам было необходимо провести нокдаун гена, а именно временно подавить его экспрессию. Трансфекцию проводили методом липофекции с помощью реагента "Липофектамин 3000". Само подавление осуществляла малая интерферирующая РНК.
3
Трансдукция
Для восстановления экспрессии гена вводили аденоассоциированный вирус с модифицированным 9-ым серотипом. В геноме вируса были заменены гены, ответственные за патогенез и репликацию вируса, на функциональный ген SMN1
4
Проточная цитометрия
Для проверки эффективности доставки препарата в клетку использовали метод проточной цитометрии, позволяющий идентифицировать клетки по интенсивности их флюоресценции
5
Метод BCA
Для определения экспрессии белка на основе нашего препарата прежде всего было необходимо лизировать клетки, выделить из них общий белок и выровнять его концентрацию во всех лунках планшета для корректного подсчёта.
6
ИФА (Иммуно-ферментный анализ) 
Чтобы непосредственно определить количество белка SMN проводили ИФА "сэндвич" методом.
7
Выделение РНК на колонках
Для получения более точных результатов проводили анализ количества мРНК SMN1 в клетках. Принцип метода основан на свойстве нуклеиновых кислот адгезироваться на силикагельной мембране в присутствии хаотропных ионов. В 2 мл пробирку без крышки вставляют колонку, к концу которой прикреплена силикагельная мембрана. При добавлении лизированных образцов на мембрану оседают только молекулы РНК, а все остальное осаждается на дне пробирки.
8
ПЦР (Полимеразная цепная реакция)
Количество РНК определяли методом ОТ-кПЦР (количественная ПЦР в реальном времени), основанной на многократной амплификации участка ДНК.

Результаты проекта в графиках


Выводы
1
Вывод №1
siRNA к SMN1 ингибирует экспрессию гена как
на уровне мРНК,
так и на уровне белка.​
2
Вывод №2
Оба препарата восстанавливают
экспрессию гена на белковом уровне.
3
Вывод №3
Существует тенденция к тому,
что первый кандидат восстанавливает
экспрессию белка эффективнее, чем второй
4
Вывод №4
Различия в уровне восстановления уровня белка
объясняются различием эффективности транскрипции.​
КОМАНДА
Мамий Ахмед
Первой Константин
Каушлиева Мария
Манакова Екатерина
Плотникова Ольга
Гоголева Дарья
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ
Мадера Дмитрий
Перекуча Наталья
Цветкова Анжела
Шеуджен Тимур
Направление "Генетика, персонализированная и прогностическая медицина"
©Большие Вызовы - 2021
Phone: +79627644016
Email: ahmedmamey11@gmail.com