Исследование влияния модификаций в праймерах на эффективность полимеразной цепной реакции

Большие вызовы
Генетика и биомедицина
Проблема

Разработка специфичных и высокочувствительных систем анализа нуклеиновых кислот – актуальная задача для направления «персонализированная медицина», которое является приоритетной тематикой развития науки Российской Федерации. Использование химических модификаций нуклеиновых кислот в праймерах для полимеразной цепной реакции приводит к повышению специфичности анализа.

Актуальность
Однонуклеотидные замены в генах могут являться первопричиной многих социально значимых заболеваний. Как правило количество мутантной ДНК может быть незначительно.

Когда процент мутаций составляет меньше 1%, процесс их обнаружения становится затруднителен.

Гипотеза
Введение химических модификаций в состав олигонуклеотидов позволяет направленно изменять их структуру, свойства и взаимодействие с биологически активными соединениями. Синтетические аналоги нуклеиновых кислот часто обладают улучшенными физико-химическими, молекулярно-биологическими свойствами, изучение которых позволит усовершенствовать имеющиеся и создать новые системы диагностики и количественного анализа различных НК-маркеров.

Наше решение


Использование фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов для выделения и анализа нуклеиновых кислот, в том числе в ПЦР.

Преимущества
Использование фосфорилгуанидиновых модификаций имеет ряд преимуществ:
  • Сохранность фермент-субстратных свойств

  • Повышение температуры плавления дуплекса

  • Возможность крупномасштабного автоматического синтеза

  • Устойчивость к действию клеточных нуклеаз

Решение
Выделение искомой ДНК
Для увеличения эффективности ПЦР анализа биологического образца, искомую нуклеиновую кислоту нужно выделить. В настоящее время все более развивается способ магнитной сепарации. Однако коммерчески доступные препараты имеют недостатки, связанные с высокой стоимостью и отсутствием варианта ковалентного присоединения зонда на поверхность магнитных наночастиц.
Исследование влияния модификаций
Использование модифицированных праймеров позволяет наработать ДНК, содержащую однонуклеотидную замену с высокой точностью.
Проведение ПЦР и анализ проб методом гель-электрофореза
Электрофорез в полиакриламидном геле позволяет проанализировать образцы, полученные после ПЦР и содержащие мутантную ДНК.
Результаты


При ферментативном удлинении наличие одиночной модификации в матричной цепи на расстоянии три нуклеотида от 3ʹ-конца не влияет на выход полноразмерного продукта. При использовании Taq ДНК-полимеразы образование промежуточных продуктов удлинения зависит от положения модификации.

Множественные ФГ-модификации в любом положении матричной цепи приводят к снижению выхода полноразмерных продуктов, однако они оказывают меньшее ингибирующее влияние, если присутствует модификация в третьем положении от 3ʹ-конца.


Ведение ФГ-звеньев в состав матричной цепи существенно ингибирует удлинение праймера при нахождении ФГО в зоне достройки олигонуклеотида.

Отдаление от 3ʹ-конца праймера ФГ-звеньев увеличивает степень накопления продукта реакции удлинения с помощью Taq ДНК-полимеразы.
Планы развития проекта
Праймеры, содержащие фосфорилгуанидиновые модификации по межнуклеотидному фосфату в выбранных позициях, будут использованы(протестированы) для повышения специфичности ПЦР анализа однонуклеотидных полиморфизмов в реальных биологических системах.
Наша команда
Руководители

  • Анастасия Евгеньевна Булгакова

  • Виктория Константиновна Попова

  • Елена Владимировна Дмитриенко

  • Мария Ивановна Мещанинова

Исследователи

  • Воронина Анна

  • Жапов Бато

  • Иванкевич Дмитрий

  • Пономарева Елизавета

  • Хамзин Роман

Наши контакты
Телефон: +7 913 904 17 42
Почта: elenad@niboch.nsc.ru