Маркер-ориентированная селекция растений на примере поиска ДНК-маркера устойчивости к чёрной пятнистости у садовых роз

Маркер-ориентированная селекция растений на примере поиска ДНК-маркера устойчивости к черной пятнистости у садовых роз

Даем надежду на пышные букеты

Партнеры

Цветы монархов и королей

В далекой древней Греции поэтесса Сафо назвала розу царицей цветов, за ее красоту и душистость. В наше время мы продолжаем любоваться этими цветами и наслаждаться их ароматом. Розы выращивают для создания букетов, сажают в парках и садах, из роз делают эфирные масла и лекарственные препараты, варенье и чай.

Цель проекта

Поиск и верификация маркеров устойчивости к чёрной пятнистости у садовых роз в условиях Федеральной Территории "Сириус"

Актуальность

Выявление сортов Rosa L. устойчивых к данному грибному заболеванию и вовлечение их в селекцию для создания новых устойчивых сортов является самым прогрессивным способом по борьбе с D. rosae.

Садовые розы подвержены множеству заболеваний, но одним из самых вредоносных и распространенных является черная пятнистость, вызываемая грибом Diplocarpon rosae F.A. Wolf. Использование методов химической защиты в ряде зон невозможно или не несет значимых результатов.

Гипотеза

Среди описанных в литериатуре молекулярных и морфологических маркеров есть макеры пригодные для маркер-ориентированной селекции по созданию устойчивых к черной пятнистости сортов садовых роз.

Решение

Необходимо было проверить есть ли связь между упомянутыми в литературе маркерами и выявленной нами устойчивостью сортов.

Выявление маркеров в геноме

Проверка связи между маркером и устойчивостью

Фенотипические исследования сортов

Выделение ДНК сортов

С праймерами на маркер 155SSR

С праймерами на маркер RGA (Rdr1A)

С праймерами на маркер 69E24

Результаты

1.Нами было установлено что возбедителем заболевания роз является D. rosae.

С праймерами на маркер ND5ESCAR

С праймерами на маркер Rd1LRR

Для 1-3 данные сорта
1 – Felicite et Perpetue (у)
2 – The Fairy(у)
3 – Борисфен (у)
4 – Седая дама (в)
5 – Наталья Муравская (в)
6 – Gloria Dei (в)

Для 4-5 данные сорта
1 – Felicite et Perpetue (у)
2 – The Fairy (у)
3 – Борисфен (у)
4 – Седая дама (в)
5 – Gloria Dei (в)
6 – Iceberg (в)
7 – Наталья Муравская (в)
8 – Sandra (в)
9 – Шиповник (у)
10 – Солнечная долина (у)

у-устойчивые
в-восприимчивые

2.Распростарённость болезни на одной из куртин парка капуса составила 100% (оценили 444 растения). 60,14% растений имели максимальную интенсивность развития болезни.

3.Нами было проверено 8 молеклярных маркеров (RGA (Rd1A), 155SSR, 69E24, ND5ESCAR, Rd1LRR, RMS015, CA60'Rdr1A, 69Mic) и установлено, что использование таких маркеров как: ND5ESCAR, Rd1LRR позволяет выявить устойчивые сорта к D.rosae в условиях влажных субтропиков России.

Подробная информация

Черная пятнистость

Вызываемая гемибиотрофным облигатным аскомицетом D. rosae, является наиболее разрушительным заболеванием, поражающим розы. [Drewes-Alwarez, 2003; Horst, 2008].
Существует большое количество рас данного грибного заболевания.

Встречаются ссылки, они выделены жирным или квадратными скобочками

Генами устойчивости к чёрной пятнистости являются гены Rdr. На данный момент выявлено 4 гена Rdr каждый отвечает за устойчивость к конкретной расе D. rosae. Это показано на таблице ниже.

Гены Rdr кодируют R-белки. Эти белки оттносятся к классу TIR-NBS-LRR белков, и как следует из их названия, NBS-LRR белки включают нуклеотид-связывающий домен (nucleotide binding site), и домен, содержащий обогащенный лейцином повтор (LRR).

R-белки играют роль в обнаружении и распознавании эффекторов патогена, инициирует передачу сигналов внутри растительной клетки. Эти сигналы приведут к различным реакциям, которые помогут в уничтожении патогена и предотвращении дальнейшей инфекции, например увеличивается производство активных форм кислорода (АФК), развивается реакция гиперчувствительности, закрываются устьица, синтезируются различные химические соединени (терпены, фенольные соединения, дубильные вещества, алкалоиды, фитоалексины, ферменты, в частности хитиназы)

Можно приблизить картинки

Из изучной литературы нами были выбраны маркеры, при помощи олигокалькулятора высчитали t°С при кторой проводили этап ПЦР, а так же убедились в корректности данных с помощью UGENE.
Здесь преставлны все 9 выбранных нами маркера с подобранными праймерами.

SSR-маркеры (Simple Sequence Repeats - простые повторяющиеся последовательности) – участки ДНК, состоящие из коротких тандемных повторов (фрагменты генома) длиной 2-6 нуклеотидов.

SCAR-маркеры ( Sequence Characterised Amplified Region) - представляют собой фрагменты ДНК, амплифицированные с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров длиной 15–30 п.н.

Выявленные в литературе молекулярые маркеры

Результаты полевых исследований

Позже нам было необходимо рассмотреть гипотезу: морфологические признаки могут считаться маркерами устойчивости к чёрной пятнистости. Для этого были произведены замеры представленных праметров, это стало возможным благодаря такому приибору как тургометр, а так же цветовой шкале королевского сельскохозяйственного общества Великобритании и проведению микроскопии.

Данные по интенсивности развития заболевания на сортах мы внесли в график. После сравнения сортов м/у собой, оказалось, что гипотеза не подтвердилась.

После того как мы поняли что морфологические параметры нельзя использовать как маркеры устойчивости, необходимо посмотреть на более глубоком уровне-молекулярном.

Определение молекулярных маркеров

Мы выделяли ДНК 2-я способами

СТАВ

СТАВ с колонками