Праймеры — один из ключевых компонентов ПЦР, от которых зависит качество продукта ПЦР. Праймеры выполняют функцию «затравки» для ДНК-полимеразы, которая присоединяет нуклеотиды к дочерней цепи по принципу комплементарности в направлении от 5’ к 3’ концу матричной ДНК.
Зонд - небольшой олигонуклеотид, который содержит два флуорофора: репортер и гаситель. Когда они находятся на одном зонде, гаситель поглощает сигнал от репортера. Во время амплификации зонд разрушается, репортер и гаситель отдаляются друг от друга, и флуоресценция репортера становится заметной.
Подбор праймеров к бактериальным генам
Из двух пар праймеров к гену 23s необходимо было подобрать 1 пару, которая не образует димеры.
Анализируя графики кривой плавления и амплификации видно, что праймеры 1 образуют димеры, поэтому для дальнейшей работы были использованы праймеры 2.
Подбор системы праймеров и зонда
Подбор зонда необходим для проведения в дальнейшем мультиплексной ПЦР. Первоначально из двух пар зондов для каждой пары праймеров (на ген 23s и actb) был выбран оптимальный - такой, чтобы его флуоресценция была интенсивнее.
Анализируя график амплификации видно что, для гена 23s подходит система праймеров с зондом 1 (репортер FAM). К гену ACTB подходит система праймеров с зондом 2 (репортер CY5)
Подбор температуры отжига праймеров
Температура отжига является важной составляющей ПЦР-теста. При неправильном подборе праймеры могут не связаться с молекулой ДНК и дальнейшая реакция не пойдет.
Поэтому с помощью градиента температур была найдена оптимальная температура отжига для каждой пары праймеров. Для дальнейших экспериментов мы взяли температуру 56 градусов.
Подбор системы праймеров и зонда
Для разработки мультиплексной пцр системы необходимо проверить, что праймеры не ингибируют друг друга.
После проверки праймеров по парам было выявлено, что в дальнейшем исследовании данные праймеры могут использоваться для одновременного анализа.)