Валидация платформы вирусоподобных частиц на основе белка PreS для создания инновационных рекомбинантных противотуберкулезных вакцин

Генетика и биомедицина
Результаты работы
Актуальность
Туберкулез – это инфекционное заболевание, вызываемое различными видами микобактерий. По данным ВОЗ 10,6 миллионов человек заболели туберкулезом в 2022 году.
БЦЖ - единственная зарегистрированная вакцина, но эффективна она только для детей.
Наше решение
Создание адъювантной белковой вакцины на основе белка PreS и антигена ESAT

PreS

основной антиген вируса гепатита В, способен формировать вирусоподобные частицы

ESAT

(early secreted antigenic target)

антиген, вырабатываемый Mycobacterium

Преимущества нашей вакцины
  • PreS - основа для создания вирусоподобных частиц
    Вирусоподобные частицы активируют оба типа иммунитета, способны имитировать структуру вируса и презентировать антигены на своей поверхности для лучшего иммунного ответа.
  • ESAT - универсальный антиген
    ESAT - консервативный, невариабельный белок, который отвечает за инфицирование клеток микобактериями; вакцину на основе данного белка можно будет применять против всех штаммов микобактерий, вызывающих туберкулез.
  • Безопасность
    Вирусоподобные частицы не несут генетической информации и не способны к заражению организма.
Цель работы
Получить химерные вирусоподобные частицы на основе PreS и ESAT для создания инновационных противотуберкулезных вакцин
Задачи
Получение разных вариантов генно-инженерных конструкций PreS+ESAT;
Подбор условий для экспрессии целевого белка;
Выделение, очистка вирусоподобных частиц и изучение их физико-химических свойств.
1
2
3
Наработка биомассы
4
Этапы работы
1
Создание генно-инженерных конструкций
  • Клонирование ДНК
  • Рестрикция ДНК
  • Лигирование ДНК
  • Трансформация ДНК в E.coli
  • Выращивание колоний на чашках Петри
  • Скрининг клонов
  • Электрофорез нуклеиновых кислот
  • Выделение ДНК
2
Культивирование
• Пересев клеток E.coli с чашек Петри в жидкую питательную среду
• Культивирование клеток E.coli в жидкой питательной среде
• Подбор условий экспрессии

• Экспрессия рекомбинантного белка

3
Выделение и очистка белка
  • Выделение телец включения
  • Солюбилизация телец включения
  • Хроматографическая очистка белка
  • Рефолдинг белка
  • Подбор буферных растворов для образования вирусоподобных частиц
4
Физико-химический анализ
  • SDS- PAGE
  • Western Blot
  • Определение размера частиц на основе DLS
Этап 1
Создание генно-инженерных конструкций
Создание 3 вариантов конструкций PreS+ESAT
  • Использовали метод ПЦР для наработки гена ESAT
  • С помощью рестриктазно-лигазного метода вставили ген ESAT в плазмиду с белком PreS
  • Трансформировали плазмиды в бактерии штамма E.coli BL21 для дальнейшей наработки биомассы

Схема получения плазмид

ЭНЗИМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Исследование структуры плазмид с помощью рестрикционных эндонуклеаз, проводится для проверки правильной сборки плазмид
С помощью энзиматического анализа мы подтвердили правильность сборки плазмид. В работе использовалась рестриктаза Rsal.
Этап 2
Культивирование
Анализ экспрессии наших рекомбинантных белков в прокариотической системе E.coli BL21
  • Клетки переносили в колбу со средой и культвировали при 37°С, после чего проводили индукцию добавлением IPTG и осуществляли аналитическую экспрессию при трех разных температурах.
  • Далее проводили пробоподготовку для проверки локализации белка. Обработку клеток проводили с помощью ультразвука. Полученные пробы центрифугировали для разделения осадка и надосадка. Затем провели SDS-PAGE для определения оптимальных условий экспрессии и его локализации в клетке.
Отбор колоний со вставленной плазмидой ESAT-PreS
Этапы 3 и 4
Выделение и очистка белка
Выделение телец включения, очистка белка посредством проведения хроматографии, изучение свойств белка
  • Использовали различные буферы для отмывки телец включения
  • Провели хроматографическую очистку белка, а также диализ
  • Чистоту полученных молекул оценили проведением SDS-PAGE
  • Размер образовавшихся частиц определен при помощи метода DLS

Результаты SDS-PAGE после проведения хроматографической очистки молекулы ESAT-PreS-ESAT

Хроматографическая очистка на HiTrap IMAC HP молекулы ESAT-PreS-ESAT
Результаты
  1. Получены генно-инженерные конструкции с разными вариантами расположения ESAT относительно PreS;
  2. Подобраны условия культивирования и наработана биомасса трёх молекул;
  3. Проведена хроматографическая очистка белков;
  4. Подобраны оптимальные буферные растворы для формирования вирусоподобных частиц;
  5. Определены размеры вирусоподобных частиц, определено влияние сахарозы в составе буферного раствора на формирование вирусоподобных частиц.
Вывод
Была разработана платформа, позволяющая создавать вакцины на основе вирусоподобных частиц
НАША КОМАНДА
  • Килина Мария
  • Дыдышко Софья
  • Шкуркина Ульяна
  • Макеева Елизавета
  • Ермакова Злата
  • Макалева Анна
НАШИ КОНТАКТЫ
Макеева Елизавета
elizabeth.mev1806@gmail.com
Килина Мария
m4sha07.kilina@yandex.ru
Макалева Анна
anamakaleva@yandex.ru
Шкуркина Ульяна
ulianashkurkina@gmail.com
Ермакова Злата
zlata.ermakova08@mail.ru
Дыдышко Софья
sofya.dydyshko@mail.ru
© 2024 большие вызовы