Создание репортерной клеточной тест-системы для поиска эффективных препаратов для лечения диабета и ожирения
Актуальность
Сахарный диабет второго типа является метаболическим заболеванием, связанным с множеством патологических состояний в особенности ожирением и сердечно-сосудистыми заболеваниями, им болеет около 6% населения земли, в связи с этим есть потребность в разработке новых препаратов.
Для лечения данного заболевания существует терапия агонистами GLP-1R. Один из таких вариантов мы и проверим в нашем проекте.
Немного про саму терапию Один из сигнальных путей после активации рецептора GLP-1 в организме животных приводит к выбросу инсулина, что оказывает терапевтический эффект. Другим последствием активации рецептора GLP-1 является повышение уровня цАМФ, и это можно использовать в наших целях, а именно добавить в клетки репортерный ген люциферазы светлячка, который будет экспрессироваться при повышении уровня цАМФ |
Что-то на научном
Агонист воздействует на рецептор и связывается с G-белком, после этого активируется аденилат циклаза, в связи с чем повышается уровень цАМФ, и как следствие активируется протеинкиназа А, которая фосфорилирует белок CREB, который является транскрипционным фактором способствующим экспрессии гена люциферазы светлячка
Цель и задачи
Цель: получить культуру клеток, содержащих гены GLP-1 рецептора и репортерного гена люциферазы светлячка для оценки биологической активности препаратов против диабета и ожирения
1
Получить лентивирусные вектора содержащие гены интереса и трансдуцировать ими клетки линии HEK 293Т.
2
Получить культуру клеток, содержащих гены GLP-1 рецептора и репортерные гены: люциферазы светлячка, зеленого флуоресцентного белка и устойчивости к пуромицину с помощью проточной цитофлуориметрии
3
Подтвердить наличие доставленных генов в геноме клеток и их экспрессию с помощью ПЦР анализа
4
Оценить биологическую активность GLP-1 агонистов с помощью репортерной клеточной тест-системы.
Процесс
Трансфекция
Первым делом нами была проведена трансфекция клеток линии HEK293T для наработки лентивирусных частиц содержащих ген GLP-1R и маркерный ген зеленого флуоресцентного белка GFP.
Для этого мы использовали плазмидные вектора , для получения лентивирусных частиц была использована система 3го поколения, которая включает в себя 3 плазмиды с генами белков упаковщиков и белков капсида и 1 в качестве вирусного генома для доставки целевого гена.
В качестве положительного контроля методики был использован вектор с геном красного флуоресцентного белка.
В качестве положительного контроля методики был использован вектор с геном красного флуоресцентного белка.
Трансдукция
Далее наши научные руководители провели трансдукцию LV частицами , с целью получения репортерной линии.
Трансдукция – это процесс, посредством которого чужеродная ДНК вводится в клетку вирусом.
Это было нужно для получения стабильной клеточной линии экспрессирующей гены GLP-1R и люциферазы светлячка.
Трансдукция – это процесс, посредством которого чужеродная ДНК вводится в клетку вирусом.
Это было нужно для получения стабильной клеточной линии экспрессирующей гены GLP-1R и люциферазы светлячка.
Проточная цитометрия
Для оценки эффективности трансдукции, мы сделали проточную цитометрию контрольных клеток с красным белком
Для оценки эффективности трансдукции, мы сделали проточную цитометрию контрольных клеток с красным белком
Сортировка клеток
Так же мы отправили клетки на сортировку, для получения моногенной культуры, где каждая клетка будет иметь ген GLP-1R
Так же мы отправили клетки на сортировку, для получения моногенной культуры, где каждая клетка будет иметь ген GLP-1R
ПЦР
После этого экспресс методом выделили ДНК из клеток, чтобы провести ПЦР с целью подтверждения наличия генов люциферазы и GLP-1R ( на картинке пцр для люциферазы)
Электрофорез
Детектировали мы ПЦР с помощью гель электрофореза, так как мы можем наблюдать четкие полосы на геле, значит ген был успешно встроен в геном наших клеток. (на фото пцр для гена GLP-1R)
ОТ-ПЦР-РВ
Так же мы выделил РНК для проведения ОТ-ПЦР-РВ, в качестве контроля мы использовали ген домашнего хозяйства RPLPO, и по результатам анализа мы видим экспрессию гена GLP-1R, но не наблюдаем экспрессию люциферазы, что также является нормой, так как мы не стимулировали эти клетки. Так же мы посчитали относительный уровень экспрессии.
Белковый электрофорез в ПААГ
Данный тест мы проводили, для подтверждения размера полипептиднной цепи получаемого агониста GLP-1R
Молекула диагониста в восстанавливающих условиях
Молекула диагониста в восстанавливающих условиях
Масс-спектрометрия диагониста
Для проверки чистоты продукта
Выводы: молекула не стабильна, наблюдается результат протеолиза
Выводы: молекула не стабильна, наблюдается результат протеолиза
Тест препаратов
Препарат лираглутида
График доза-зависимости лираглутида в клетках линии HEK293T с люциферазным цАМФ зависимым репортером после трансдукции генов рецептора GLP1 и маркерного гена GFP, сравнение двух люциферазных клона.
Вывод: в данном эксперименте мы проверили два клона клеток. Увеличение сигнала люминесценции мы увидели только у первого клона. Его мы в дальнейшем и использовали для тестов.
Вывод: в данном эксперименте мы проверили два клона клеток. Увеличение сигнала люминесценции мы увидели только у первого клона. Его мы в дальнейшем и использовали для тестов.
Антителоподобная молекула диагонист рецепторов GLP-1 и GIP
График доза-зависимости диагоста в клетках линии HEK293T с люциферазным цАМФ зависимым репортером после трансдукции генов рецептора GLP1 и маркерного гена GFP, сравнение двух люциферазных клона
Вывод: в связи с увеличением сигнала люминесценции можем говорить, что препарат работает.
Вывод: в связи с увеличением сигнала люминесценции можем говорить, что препарат работает.
Новые малые молекулы агонисты GLP-1R с неизвестной активностью
График доза-зависимости малой молекулы SAK127 в клетках линии HEK293T с люциферазным цАМФ зависимым репортером после трансдукции генов рецептора GLP-1 и маркерного гена GFP
График доза-зависимости малой молекулы SAK132 в клетках линии HEK293T с люциферазным цАМФ зависимым репортером после трансдукции генов рецептора GLP-1 и маркерного гена GFP
Выводы: в связи с увеличением сигнала люминесценции, а значит данные молекулы в теории можно использовать в качестве агонистов GLP-1 рецептора.
Выводы: в связи с увеличением сигнала люминесценции, а значит данные молекулы в теории можно использовать в качестве агонистов GLP-1 рецептора.
Результаты и выводы по проекту
- 1Получили лентивирусные векторасодержащие гены интереса и трансдуцировать ими клетки линии HEK293Т.
- 2Получили культуру клетоксодержащих гены GLP-1 рецептора и репортерный ген люциферазы светлячка, а также маркерные гены.
- 3Подтвердили наличие доставленных геновв геноме клеток и их экспрессию с помощью ПЦР анализа.
- 4Оценили биологическую активность GLP-1 агонистовс помощью репортерной клеточной тест-системы
- 5Для корректных результатов нужна моноклональная линияподбор условий для новых препаратов, более высокая концентрация препаратов, корректный референс
Мы создали основную платформу и далее, в течение длительного времени, её нужно дорабатывать.
Дальнейшее развитие проекта
1
Получение моноклональной линии
2
Настройка теста, подбирая состав препарат и диапазон концентраций
Человек собравший эту шедевро команду
Александр - БИГ БОСС - Карабельский
Наши научные руководители
- Алиса - мать проекта - Краснодубец
- Дзерасса - молекулярная тянка - Гурциева
- Мария - милашка - Васильева
- Дмитрий - рнк фан - Кунык
Участники
- Дарина - мадам ПЦР - Меретукова@disturbingmoth
- Марина - мама ламинара - Макарова@marinamakarova7
- Рената - отвечает она, а стыдно всем - Мустафина@sausage_princess
- Ирина - красотка - Калашникова@I_rish_kka
