Оценка антипролиферативной активности в рамках фенотипического скрининга

Проект, призванный найти первые в своём роде вещества, подавляющие рост и развитие опухолевых клеток. Это первая и самая важная ступень в поиске лекарств от рака

Глоссарий

Термины и понятия, которые мы применяли в работе

Актуальность проекта

Рак на данный момент занимает второе место в мире по смертности. Это заболевание является трудноизлечимым. Несмотря на то, что существует не один способ лечения рака, они не всегда являются эффективными.

Именно поэтому наша команда занялась фенотипическим скринингом. Фенотипический скрининг - это один из самых актуальных и современных способов для поиска и создания препаратов first-in-class, то есть первых в своём роде.

ЦЕЛЬ

Оценить антипролиферативную эффективность (эффективность подавления роста и деления) веществ-кандидатов на 3D-моделях рака.

Задачи

ЗАДАЧА №1
Культивирование пяти разных клеточных линий рака человека

ЗАДАЧА №2
Формирование 3D и 2D моделей из культивированных линий

ЗАДАЧА №3
Титровка веществ к клеткам

ЗАДАЧА №4
Сравнение полученных результатов на разных моделях клеточных линий и оценка антипролиферативной активности веществ

Клеточные линии

которые были взяты для экспериментов

PANC-1

Линия PANC-1 была получена от 56-летнего мужчины с аденокарциномой поджелудочной железы. Данная линия характеризуется повышенной агрессивностью и скоростью инвазии в соседние органы, а также метастазированием.

УЗНАТЬ БОЛЬШЕ

HGC-27

Линия HGC-27 - агрессивный рак желудка. Карцинома, полученная из лимфатического узла пациента из Японии. Рак желудка очень сложно вылечить, ведь чаще всего его обнаруживают при прорастании в соседние органы либо при метастазировании

УЗНАТЬ БОЛЬШЕ

А549

Линия клеток A549 была получена в 1972 г из ткани легкого 58-летнего мужчины европеоидной расы. Клетки A549 представляют собой альвеолярные базальные эпителиальные клетки. Эта клеточная линия имеет тенденцию быть менее агрессивной и менее быстро распространяться, чем мелкоклеточная карцинома легкого, но оказывается более распространенной.

УЗНАТЬ БОЛЬШЕ

НСС70

Это трижды негативный рак молочной железы - самый залеченый вид рака и один из самых агрессивных. Линия была выделена у 49-летней чернокожей женщины в 1992 году, и для приживления клеток потребовалось 44 месяца.

УЗНАТЬ БОЛЬШЕ

А2780

Линия А2780 - линия рака яичника, получена из эндометриоидной аденокарциномы.

Этапы работы

Культивирование клеток

Для начала нам необходимо "снять" клетки с клеточного матраса с помощью трипсина - фермента, разрежающего белки, которыми клетки держатся за стенку матраса. Потом мы узнаём концентрацию клеток и их выживаемость чтобы в правильных пропорциях высеять их в планшеты для 3D культур

Титровка кандидатов

Мы получаем различные концентрации веществ-кандидатов с помощью метода титрования, таким образом можно найти оптимальную концентрацию вещества, подавляющего пролиферацию клеток. Чтобы знать, что мы не ошиблись мы имеем отрицательный контроль - там отсутствуют действующие вещества и формируется нормальный сфероид, и положительный с априори действующим веществом - цитостатиком

Оценка антипролиферативной активности

Чтобы оценить эффективность кандидатов мы используем PrestoBlue - это краситель, который изменяет свой цвет с синего на розовый и начинает флуоресцировать в живых клетках (он восстанавливается НАДН). И по степени флуоресценции мы определяем эффективность вещества

Результаты

Результатом нашей работы являются графики, показывающие IC50 для веществ-кандидатов, помимо численных данных мы имеем микрофото сфероидов для сравнения (вещества кандидаты зашифрованы и указаны под численными номерами). Также нашим подпроектом является сравнения 2D и 3D культур.

Control - отрицательный контроль (сфероид без добавления веществ.
Paclitaxel, Cytarabine, Oxaliplatin, Niraparib - цитостатики, вещества положительного контроля.

3D

2D

HGC-27 Рак желудка

Control

Cytarabine 0.12 мМ*

338 max conc.

338 0.12 мМ*

IC50 = 331 nM

IC50 = 256 nM

IC50 = 272 nM

IC50 = 1895 nM

Cytarabine
338

5x

Cytarabine max conc.

3D

2D

Control

348 max conc.

348 0.12 мМ*

440 max conc.

440 0.12 мМ*

IC50 = 161 nM

IC50 = 348 nM

IC50 = 481 nM

IC50 = 940 nM

*концентрация 0.12 mM является промежуточной между максимальной и отрицательным контролем

Cytarabine - положительный контроль (априори ингибируют пролиферацию) лучше действует на 3D культуры
338 кандидат одинаково влияет на 3D и 2D. 348 и 440 кандидаты оказывают умеренное антионкогенное действие на 3D моделях

348
440

5x

348
440

3D

2D

PANC-1 рак поджелудочной железы

Control

Paclitaxel max conc.

Paclitaxel 0.12 мМ

Oxaliplatin max conc.

Oxaliplatin 0.12 мМ

IC50 = 2245 nM

IC50 = 30 nM

IC50 = 328 nM

IC50 = 7 nM

Paclitaxel
Oxaliplatin

Cytarabine
338

10x

3D

2D

Control

485 max conc.

485 0.12 мМ

74 max conc.

74 0.12 мМ

IC50 = 444 nM

IC50 = 23 nM

IC50 = 16 nM

IC50 = >10000 nM

Paclitaxel и Oxaliplatin оказывают умеренное действие как на 2D так и на 3D
485 очень мощно подавляет рост опухоли но согласно исследованиям BIOCAD вещество крайне токсично. 74 проявляют среднюю эффективность на 3D, но на 2D видимого результата не даёт.

485
74

5x

10x

74
485

3D

HCC70 рак молочной железы

Control

Paclitaxel max conc.

Paclitaxel 0.12 мМ

346 max conc.

346 0.12 мМ

IC50 = 2245 nM

IC50 = 30 nM

Paclitaxel
3-46

5x

3D

Control

341 max conc.

341 0.12 мМ

440 max conc.

440 0.12 мМ

IC50 = 259 nM

IC50 < 1.4 nM

Paclitaxel и Oxaliplatin оказывают умеренное действие
3-46 показывает очень мощный эффект при небольшой концентрации
341 не показал действенного эффекта
440 имеет лучшее действие по сравнению с 440, это видно по картинкам

341
440

5x

10x

5x

3D

2D

A549 рак лёгкого

Control

Cytarabine max conc.

Cytarabine 0.12 мМ

441 max conc.

441 0.12 мМ

IC50 = 345 nM

IC50 = 445 nM

IC50 = 851 nM

IC50 = 285 nM

Cytarabine
441

10x

3D

2D

Control

3-46 max conc.

3.46 0.12 мМ

L18 max conc.

L18 0.12 мМ

IC50 = 55 nM

IC50 = 951 nM

IC50 = >10000 nM

IC50 = 3899 nM

Cytarabine оказывает мощное действие как на 3D и умеренное на 2D
441 очень мощно подавляет рост опухоли. 3-46 уменьшает объём сфероида но совершенно не влияет на монослой. Так и L-18 видимого действия на 2D по сравнению с 3D не оказывает

3-46
L-18

10x

3-46
L-18

3D

2D

A2780 рак яичника

Control

Niraparib max conc.

Niraparib 0.12 мМ

Oxliplatin max conc.

Oxaliplatin 0.12 мМ

IC50 = 509 nM

IC50 = 192 nM

IC50 = 293 nM

IC50 = >10000 nM

Niraparib
Citarabine

10x

Niraparib
Citarabine

3D

2D

Control

69 max conc.

69 0.12 мМ

74 max conc.

74 0.12 мМ

IC50 = 405 nM

IC50 = 133 nM

IC50 = 249 nM

IC50 = 581 nM

Niraparib (новейший противоопухолевый препарат) не действует на 2D, но эффективно подавляет рост 3D. Oxaliplatin оказывает умеренное действие.
69 в четыре раза эффективнее на сфероидах, а 74 лучше действует на 2D

69
74

10x

69
74

Выводы

1

Освоение методик
Участники проекта освоили культивирование клеточных линий и постановку экспериментов.

2

Создание препарата
Были обнаружены активные молекулы, которые в дальнейшем можно использовать для их оптимизации и создания препарата.

3

2D и 3D
Сравнили данные о клеточных линиях в 2D и 3D форматах для определения механизма действия веществ в дальнейших испытаниях.

Вещества-кандидаты, проявившие наилучшие антипролиферативные свойства на 3D моделях

Команда

Эдеева Алтана
Линия HCC70
Интересуется генной инженерией. Родом из Калмыкии. Не может определиться между наукой и профессиональным моделингом.
Мосеева Елена
Линия A2780
Приехала приехала в "Сириус" из города Ижевска с проектом про экстракцию чая. Любит заниматься воздушной гимнастикой, бильярдом. Увлекается физикой и информатикой.
Глебов Клим
Линия PANK-1
Интересуется молекулярной биологией и генетикой и в будущем мечтает работать на благо науки.

Парфенова Виктория
Линия A549
Интересуется генетикой, онкологией и биомедициной. В будущем планирует стать онкологом.
Потатуркина Дарья
Линия HGC-27
В будущем хотела бы заниматься практической медициной, сейчас интересуюсь генетикой и анатомией человека.

РУКОВОДИТЕЛИ

ТЯЖЕЛЬНИКОВ СТАНИСЛАВ

Проработал 15 лет в Пермской государственной фармацевтической академии на кафедре токсикологической химии, а впоследствии проректором по развитию и инновациям. Сейчас работаю в АО BIOCAD и отвечаю за клеточную и биохимическую характеризацию малых молекул и привлечение новых технологий.

ДОНСКАЯ ИЛОНА

Закончила Белорусский государственный университет, биологический факультет, после чего закончила магистратуру на базе института биофизики. В Biocad с 2019 года, начинала свой путь в компании с проекта по CAR-T. На данный момент наша команда занимается поиском нового противоракового препарата с использованием фенотипического скрининга.

ЛИТАУ ЕКАТЕРИНА

Я закончила бакалавр Royal Holloway University of London и магистратуру в King’s College London. Работала в больницах (операционные и реанимация для новорождённых) и лабораториях. Пришла в проект случайно, искала компании, которые занимаются поиском терапии для лечения онкологии.

МАЛАНХАНОВА ТУЯНА

Училась в СУНЦ НГУ, а затем в НГУ. Возможно первая в России защитила студенческий диплом, где использовалась система CRISPR/Cas9. Могу отредактировать любой геном и получить плюрипотентные стволовые клетки и клеток крови или кожи кого угодно. С командой Биокад ищу лекарство от рака

ШЕУДЖЕН ТИМУР

Закончил КубГУ по специальности микробиологии. Пришёл в проект совсем не случайно, а очень даже направленно, поскольку проведение и поддержка научных проектов в ЛЭВМ (Лаборатория экспериментальной валидации мишеней) BIOCAD давно стало традицией.

ЦВЕТКОВА АНЖЕЛА

Закончила Башкирский государственный медицинский университет и сейчас занимаюсь валидацией мишеней по новым идеям для BIOCAD.

Всегда мечтала жить у моря и вот я в Сириусе)

belarusianpotatoes@BIOCAD.COM

ОСТАЛИСЬ ВОПРОСЫ?

Большие Вызовы 2022
AO BIOCAD