Мы оптимизируем протокол генетической трансформации сои — сложной для этой методики культуры — чтобы в будущем редактировать гены засухоустойчивости. Это шаг к продовольственной безопасности и технологической независимости отечественной агробиотехнологии.
Наш проект направлен на разработку эффективного протокола трансформации для одного из важнейших сельскохозяйственных растений
Создание отечественных засухоустойчивых сортов сои культурной с заданными свойствами имеет важное значение в условиях глобальных изменений климата. Использование современных методов геномного редактирования позволяет значительно сократить сроки выведения новых линий по сравнению с классической селекцией. Выявление ключевых генов-мишеней закладывает основу для направленного редактирования признаков.
Соя культурная (Glycine max (L.) Merr.) — стратегическая культура мирового сельского хозяйства с полностью секвенированным геномом, что делает её удобным объектом для генетических исследований.
Представители семейства Бобовые крайне сложно поддаются трансформации.
Оптимизация протокола трансформации бобовых и сои в частности — актуальный вызов для создания засухоустойчивых сортов сои для выращивания в Российской Федерации.
Апробация протокола агробактериальной трансформации и получение трансформантов сои — носителей конструкций с сайт-специфической нуклеазой Cas9 для направленного редактирования генов засухоустойчивости.
Введение в культуру in vitro образцов сои из коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений, а также выбор экспланта.
Проведение анализа генов засухоустойчивости сои и последующий подбор эффективных направляющих РНК.
Непосредственная постановка агробактериальной трансформации с использованием подготовленных конструкций.
ПЦР-анализ ДНК, выделенной из трансформантов.
Определение типа экспланта и генотип-специфических особенностей образцов сои позволит успешно использовать представленный протокол для генетической трансформации данной культуры с целью дальнейшего редактирования генов засухоустойчивости.
Современный сорт для промышленного выращивания. Исследования в лесостепной зоне РФ выявили его потенциальную неустойчивость к засушливым условиям.
Исторический сорт, используемый как эталонный материал для изучения механизмов адаптации и стрессоустойчивости сои.
Высокая вирулентность, индукция ризогенеза
В дикой природе вызывает "корончатый галл"
Начальный этап культивирования тканей.
На первом этапе подготовили экспланты двух сортов: Нордик 5 и Fruhe Braune. В качестве эксплантов использовали части гипокотиля, семядольные узлы и листья. Затем инокулировали экспланты бактериями Rizobium radiobacter (Fruhe Braune) и Rizobium rhizogenes (Нордик 5).
| Тип экспланта | Нордик 5 | Fruhe Braune |
|---|---|---|
| Листья | 13 шт. | 8 шт. |
| Гипокотиль | 50 шт. | 39 шт. |
| Семядольные узлы | 21 шт. | 24 шт. |
| Тип экспланта | Нордик 5 | Fruhe Braune |
|---|---|---|
| Листья | 5 шт. | 4 шт. |
| Гипокотиль | 15 шт. | 17 шт. |
| Семядольные узлы | 4 шт. | 7 шт. |
Компьютерное моделирование и подготовка генетической конструкции.
| Ген | Идентификатор (SoyBase) | Функция | Автор статьи, год |
|---|---|---|---|
| GmbZIP15 | Glyma.02G161100 | Транскрипционный фактор | Man Zhang et al., 2020 |
| GmHdz4 | Glyma.11g069400 | Транскрипционный фактор | Zhong Xuanbo et al., 2022 |
| GmPUB21 | Glyma.02G242900 | E3-лигаза | Yunhua Yang et al., 2022 |
| GmSRS18 | Glyma.16G132100 | Транскрипционный фактор | Shu-Ping Zhao et al., 2020 |
Молекулярный анализ и работа in vitro.
Выделение тотальной ДНК проводили из гипокотелей и семядольных узлов трансформированных растений сорта Нордик 5 и Fruhe Braune, полученных в результате агробактериальной трансформации на сорбенте по следующей схеме:
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась с целью подтверждения наличия вставки Т-ДНК в геном растений-трансформантов. Использовались специфические праймеры, комплементарные последовательностям генов Cas9, GFP (зелёный флуоресцентный белок) и Km (ген устойчивости к канамицину). Полученные продукты ПЦР анализировали методом агарозного гель-электрофореза для визуализации фрагментов ожидаемого размера.
Комплексный анализ фенотипических изменений и молекулярной трансформации эксплантов сои.
При сокультивировании с Rhizobium radiobacter наблюдается активное деление клеток и образование трансформированной каллусной ткани.
Rhizobium radiobacter способствует дифференциации и успешному образованию трансформированных побегов в исследуемых культурах.
У эксплантов, сокультивированных с Rhizobium rhizogenes, зафиксировано интенсивное формирование корней (ризогенез).
Эффективность проведения трансформации подтверждается результатами электрофореза. Ориентируясь на темпы регенерации после инокуляции агробактериями, мы провели сравнительный анализ сортов.
Сорт: Fruhe Braune
Сорт: Нордик 5
Полученные результаты агробактериальной трансформации эксплантов сои свидетельствуют о возможности успешного использования апробированного протокола для генетического редактирования этой культуры. Сорт Нордик 5 продемонстрировал более высокую эффективность регенерации в сравнении с сортом Fruhe Braune, что указывает на лучшую восприимчивость к агробактериальной трансформации. На основании проведенного исследования, сорт Нордик 5 может быть рекомендован для дальнейших работ по направленному редактированию генов засухоустойчивости.
Масштабирование методов от базовой трансформации тканей до высокоточного направленного редактирования генома.
Научный консультантКрылова Екатерина
РуководительМинко Дарья
АссистентКлимова Полина
СтажёрТимаева Алина
УчастникАтаева Сафия
УчастникКрымкина Виктория
УчастникОгнева Евгения
УчастникСалихова Хадиджа
УчастникСоснина Анастасия
УчастникЖариков Илья
Научный консультантКрылова Екатерина
РуководительМинко Дарья
АссистентКлимова Полина
Нажмите на фото, чтобы сменить
