Большие вызовы
ГМО мыши для тестирования вакцин
на шаг ближе к победе над SARS -CoV-2
Тема SARS-CoV2 остается актуальной уже продолжительное время, лаборатории занимаются постоянной разработкой новых вакцин, но возникает проблема с тестированием. В борьбе с нашим общим врагом мы решили продолжить труды наших научных руководителей и исследовать природу встройки трансгена в организм мыши, дабы устранить проблему тестирования вакцин.
"Просто существует вероятность лабораторной ошибки"
У мышей есть свой рецептор ACE2,но он не восприимчив к SARS-CoV-2,встроенный трансген включал в себя человеческий рецептор hACE2,промотор CAG первая часть которого была взята у цитамегаловирса,вторая часть это ген бета актина курицы и ген беттаглобина кролика.
Встройка трансгена прооисходила с помощью микроиньекции в мужской пронуклеус зиготы.
Встройка трансгена прооисходила с помощью микроиньекции в мужской пронуклеус зиготы.
Трансгенная мышь(F0) была скрещена с мышью дикого типа(WT),чье потомство использовалось для дальнейшего изучения структуры трансгена.
Исходя из вышесказанного нами была поставлена цель,которая заключается в исследовании локуса встройки трансгена в организм мыши,обеспечивающего восприимчивость к SARS-CoV-2.
Для выполнения цели,нами были использованы методы,которые описаны ниже:
1.Фенолхлорофорный метод выделения ДНК - наиболее качественный метод подготовки материала,который заключается в многоэтапной очистке образцов,с помощью лизирующего буфера,фенола и хлороформа для получения высокомолекулярной ДНК.
2.ПЦР с детекцией методом электрофореза - метод,заключающийся во множественной амплификации выделенных высокомолекулярных фрагментов ДНК.Следующий этап (детекция электрофорезом) это визуализация фрагментов(распределённых по длине) в агарозном геле.
3. CRISPR/Cas - на данном этапе мы тестировали работу данной системы на ПЦР продуктах,для дальнейшего использования при подготовке библиотек к секвенированию.Работа заключалась во внесении разрывов цепи в определенных локусах.
4.Секвенирование на Oxford Nanopore - для проведения данного этапа мы подготовили ДНК,библиотеки,выполнив их количественную и качественную оценку.Так же в этот этап входило обогащение библиотек с помощью системы CRISPR/Cas (3).
Этот этап нужен нам для определения места встроки локуса трансгена.
Для выполнения цели,нами были использованы методы,которые описаны ниже:
1.Фенолхлорофорный метод выделения ДНК - наиболее качественный метод подготовки материала,который заключается в многоэтапной очистке образцов,с помощью лизирующего буфера,фенола и хлороформа для получения высокомолекулярной ДНК.
2.ПЦР с детекцией методом электрофореза - метод,заключающийся во множественной амплификации выделенных высокомолекулярных фрагментов ДНК.Следующий этап (детекция электрофорезом) это визуализация фрагментов(распределённых по длине) в агарозном геле.
3. CRISPR/Cas - на данном этапе мы тестировали работу данной системы на ПЦР продуктах,для дальнейшего использования при подготовке библиотек к секвенированию.Работа заключалась во внесении разрывов цепи в определенных локусах.
4.Секвенирование на Oxford Nanopore - для проведения данного этапа мы подготовили ДНК,библиотеки,выполнив их количественную и качественную оценку.Так же в этот этап входило обогащение библиотек с помощью системы CRISPR/Cas (3).
Этот этап нужен нам для определения места встроки локуса трансгена.
Фотографии данных методов прикреплены в галерее 1.
Культуральные работы
На данном этапе работы мы культивировали клетки MEF(mouse embrional fibroblasts,эмбриональные клетки фибробластов мышей) в среде DMEM,для дальнейшей детекции с помощью флуоресценции для определения функциональности трансгена.
Для оценки функциональности трансгена с помощью флуоресценции мы использовали комплекс RBD*+биотин+стрептавидин+фикоэритрин
(флуоресцентная метка),который присоединяется к рецептору ACE2,закодированному в трансгене.
*RBD - белок шипа короновируса
Флуоресценцию мы проверяли с помощью проточного цитометра CytoFLEX.