Ликвидация стареющих клеток:
влияние на опухолевый рост

«Генетика и биомедицина»
На сегодняшний день большое количество людей страдают от опухолевых заболеваний. В 2021 году их число составило примерно 4 млн человек в России, из которых 65 процентов - это люди пожилого возраста.
Как вылечить рак?
Воздействовать на его микроокружение!

Опухоль состоит не только из раковых клеток. В ее микроокружение входят иммунные клетки, кровеносные и лимфатические сосуды, фибробласты, которые ассоциированны с опухолью (ФАО), а также стареющие клетки.
В 2022 году Douglas Hanahan опубликовал третью статью The Hallmarks of Cancer, в которой он включил стареющие клетки в перечень факторов развития опухоли.
Для детектирования стареющих клеток мы использовали их отличительные маркеры:
1) Остановка деления. Стареющие клетки не делятся.
2) Стареющую клетку отличают особые белки p16 и p21 - ингибиторы клеточного цикла. Их накопление - маркер стареющих клеток.
3)Важным индикатором клеточного старения являются секретируемые в среду вещества, называемые SASP (ассоциированный со старением секреторный фенотип). Комбинация веществ содержащихся в SASP уникальна для стареющих клеток.
4)В стареющих клетках увеличивается количество лизосом, соответсвенно увеличивается количество ассоциированной со старением beta-галактазидазы (SA-beta-Galactosidase) - гидролазы, которая катализирует гидролиз beta-галактазидов в моносахариды только в стареющих клетках.
(фото 1)

Недавно были обнаружены новые препараты, называемые сенолитиками. Применяя сенолитическую терапию, мы ликвидируем стареющие клетки.

Цель проекта
Выяснить как удаление стареющих клеток влияет
на рост и развитие опухоли.
Задачи
1
Оценить эффективность сенолитической терапии на культуру ФАО и МАО с помощью определения маркёров стареющих клеток.

2
Оценить изменения в количестве и экспрессии IL-6 в ФАО и МАО в результате сенолитической терапии.
3

Оценить влияние

ФАО и МАО стареющие+ и стареющие-

на опухолевые клетки.

Методы

Для достижения поставленной цели

в процессе нашей работы мы использовали следующие методы :

Прижизненная микроскопия «IncuCyte»
Для определения эффективности сенолитического препарата навитоклакс. Чем меньше стареющих (зеленых) клеток в лунке, тем действие сенолитика лучше.

Оценка миграции клеток методом анализа
заживления ран
Для оценки степени метастазирования опухолевых клеток при добавлении среды от фибробластов, пролеченных сенолитиками и непролеченых.

Гистохимический анализ
с использованием
SA-beta-Galactosidase
В результате старения в клетке повышается концентрация фермента SA-beta-Galactosidase, это является маркером старения. Чтобы задетектировать этот фактор, мы добавляли в среду с клетками хромогенный субстрат хGal, состоящий из галактозы и молекул индола. Фермент расщеплял субстрат, молекулы индола связывались между собой и окрашивали стареющие клетки в синий цвет.
Иммунофлюоресцентный анализ на белки p16 и p21
Он заключается в выявлении антигенов с помощью специфических антител с флюоресцентными метками, которые связываются с белками p16 и p21. Если белки в клетке есть, то она окрашивается зеленым, это свидетельствует, что клетка стареющая.
Конфокальная микроскопия

Конфокальное изображение стареющих клеток кожных фибробластов. Они светятся зеленым цветом.

ИФА
(Иммуноферментный анализ)
Этот метод позволил определить концентрацию цитокина IL6 в секретоме стареющих клеток.
ПЦР в режиме реального времени (RT PCR)
С помощью данного метода мы проанализировали экспрессию генов (определяли транскриптом) популяции ФАО.
Результаты
В результате гистохимического анализа с использованием окрашивания SA-beta-Galactosidase мы выявили эффективность сенолитического препарата навитоклакс в концентрации 0,75 мкМ, так как мы видим снижение количества окрашенных синим цветом клеток.
Снижение уровня секреции проопухолевого цитокина IL6 после сенолитической терапии навитоклаксом в случае индуцированного старения.

При удалении стареющих клеток уменьшается уровень метастазирования опухолевых клеток.
Наша работа показала, что навитоклакс является эффективным сенолитическим препаратом, способным удалять стареющие клетки различного происхождения.

Удаление стареющих клеток из микроокружения опухоли приводит к уменьшению миграционного потенциала опухолевых клеток посредством изменения спектра цитокинов.

Команда
Руководитель проекта
Дарья Алексеевна БОГДАНОВА
Участник проекта
Дарья Викторовна ДИК
Руководитель проекта, эксперт
Екатерина Олеговна ГУБЕРНАТОРОВА
Участник проекта
Анастасия Олеговна ГУБЕРНАТОРОВА
Руководитель проекта
Олег Николаевич ДЕМИДОВ
Участник проекта
Елизавета Сергеевна ИОНОВА
Руководитель проекта, эксперт
Марина Сергеевна ДРУЦКАЯ
Участник проекта
София Андреевна НАУМОВА
Руководитель проекта
Ксения Александровна ЛЕВЧУК
Участник проекта
Анастасия Ивановна СКРИПЕЛЕВА
Участник проекта
Илья Олегович УМИЛИН
«Старость клеток в радость»
А это красивые мы)