Белки - неотъемлемая часть дневного рациона человека, ведь именно с ними организм получает незаменимые аминокислоты. Наша цель - с помощью методов биоинформатики и генной инженерии модифицировать вициллин - запасающий белок гороха - для повышения его пищевой ценности.
Перспективы
- 1Создание новых растений, способных обеспечить потребность в пище на территориях, где наблюдаются такие трудности.
- 2Создание рациона питания, полностью удовлетворяющего потребности человека. Это необходимо как для тяжёлых профессий - космонавтов, военных, шахтеров, так и для людей, приверженных вегетарианскому рациону питания, для некоторых групп населения с пищевыми расстройствами и многих других людей.
- 3Метод, примененный для конструирования белка, в случае его успеха на растениях может быть применен и для других задач, например таких как создание антител против различных заболеваний.
Ход работы
I этап:
биоинформатическая часть
Нами был выбран запасающий белок гороха vicilin, который был проанализирован с помощью сайта PDB (protein data bank).
Данный белок имеет в составе все необходимые человеку (невоспроизводимые им) аминокислоты, однако при его употреблении наблюдается нехватка одной аминокислоты - метионина, что вызывает недостаточную усвояемость белка. В данном проекте вициллин был модифицирован посредством замены на метионин наиболее похожих на него аминокислот - валина, лейцина и изолейцина.
С помощью программы PyMOL был визуализирован тример вициллина.
С использованием сайта SWISS-MODEL дополнили исходный мономер недостающими аминокислотными фрагментами.
После, на PyMOL и с помощью специального скрипта выделили поверхностные аминокислоты, которые планируется заменить.
Замена поверхностных аминокислот, по сравнению с аминокислотами в составе ядра, не должна сильно изменять пространственную структуру белка.
При помощи PyMOL провели мутацию на мономере вициллина, заменяя валин, лейцин и изолейцин на метионин, учитывая количество и силу сталкивания атомов при замене аминокислоты: старались свести к минимуму.
Фотографии ниже показывают процесс замены:
Красные и зеленые круги на втором изображении - это столкновения с другими атомами, которые нужно избегать.
На третьем же изображении красным цветом выделены аминокислоты, замененные на метионин, итоговый мономер.
После осуществления мутаций, с помощью сайта Aggrescan3D сравнили агрегацию нашего белка до мутации и после, визуализировали результаты в виде диаграммы, по которой видно: агрегация белка почти не изменилась. Таким образом можно предположить, что внесение мутаций не повлияло на пространственную структуру белка.
Значения выше нуля (по вертикальной шкале) означают агрегацию белка в области этой аминокислоты. Если же значение ниже, то в этом месте белок не агрегирует.
Черный график - до мутации, красный - после
(нажмите, чтобы увеличить)
II этап:
биоинженерная часть
На основе разработанной нуклеотидной последовательности были получены олигонуклеотиды. Из олигонуклеотидов были синтезированы 3 фрагмента гена вициллина, которые затем были отсеквенированы и объединены.
С помощью ПЦР фрагменты гена вициллина были амплифицированы и клонированы в плазмиду pJet. Затем была осуществлена трансформация бактерий Escherichia coli полученной плазмидой.
С помощью ПЦР скрининга удалось выяснить, в каких колониях имеется плазмида, содержащая фрагмент требуемой длины.
- С помощью биоинформатики мы спроектировали модифицированную аминокислотную последовательность вициллина с целью увеличения его пищевой ценности.
- На основе спроектированной аминокислотной последовательности была создана нуклеотидная последовательность для синтеза гена de novo.
- Были синтезированы de novo и клонированы в вектор pJET 3 фрагмента гена вицилина для дальнейшего секвенирования.
- Секвенирование показало, что 2 из 3 фрагментов были успешно собраны, но содержат 2 мутации, вызывающие аминокислотные замены.
- С использованием синтезированных фрагментов удалось успешно получить большую часть гена вицилина с модифицированными аминокислотами(291 аминокислот из 450).
- Скребенков Евгений Александровичпреподаватель, исследовательЗнаток биоинформатики. Если нужно узнать что-то из генетики в компьютерном плане - положитесь на Евгения. В любое время готов рассказать обо всем простым языком и поддержать в случае необходимости.
- Сухов Иван Борисовичпреподаватель, исследовательОчень умный и самый серьезный преподаватель. Никаких лишних движений, действий, слов. Все четко и по плану, старается всегда работать на 5 с плюсом.
- Богомаз Денис Игоревичпреподаватель, исследовательСамый опытный среди преподавателей - за спиной многолетний опыт, а впереди еще много новых достижений. Человек с огромным кругозором, что очень полезно в нашем деле.
- Павлова Ольга Андреевнапреподаватель, исследовательИмеет огромный опыт в лабораторном деле и способна решить любую проблему.
- Ведяйкин Алексей Дмитриевичпреподаватель, исследовательУниверсальный научный сотрудник, способный разобраться во всем. Ловит информацию на лету и сразу же пользуется ей. Всегда спокоен и рассудителен.
- Морозова Наталия Евгеньевнапреподаватель, исследовательСпокойна и рассудительна, прекрасно обращается с лабораторным оборудованием.
- Троцюк АндрейученикЛичинка биоинформатика. Много грации в PyMOL, Aggrescan3D, Swiss-MODEL, SnapGene. Провел пару успешных попыток с электрофорезом и не взорвал лабораторию. Фотографирует, как бог. Создатель сайта и 3д модели белка как в реальности, так и за экраном компьютера.
- Пигулева МарияученикКандидат в мастера спорта по электрофорезу, грациозно, плавным движением руки, загружает данные в DNAWorks.
- Костикова АнастасияученикМастер спорта по электрофорезу, Обращается с DNAWorks с ловкостью бабочки и делает успехи. Командный голос разума.
- Буркова МарияученикПобеждает ПЦР с закрытыми глазами. Пипетирует максимально отточенными движениями. После нее не пострадала ни одна кишечная палочка.
- Сидорова АлисаученикМагистр пипетирования, мастер сайта Primer-BLAST. Собрала презентацию из подручного материала, как малыш лего без инструкции.
Фотоотчет
Санкт-Петербургский Политехнический университет Петра Великого, г. Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д. 11
Телефон: +7 (812) 2909500
Руководитель проекта Д.И. Богомаз
E-mail: bogomazden@mail.ru
© Большие Вызовы, 2022
sochisirius.ru