Разработка репортерного клеточного теста на примере антителозависимой клеточной цитотоксичности для оценки активности терапевтических антител​
Генетика и биомедицина
Актуальность

Согласно последним данным, онкологические заболевания располагаются на втором месте по смертности во всём мире, и существующие методы лечения показывают варьирующую эффективность. Одно из активно-развивающихся и прогрессивных направлений - иммунотерапия. Её преимущество - таргетность процесса.

Российский препарат на основе моноклональных антител
Препарат для лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфолейкоза, ревматоидного артрита, гранулематоза с полиангиитом и микроскопического полиангиита.​
Механизм действия клеточного теста - антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC)
Препарат Ритуксимаб своими Fab-фрагментами специфически связывается с поверхностными рецепторами СD20 клеток-мишеней, а Fc-фрагментом - соединяется с CD16 рецептором на клетках-эффекторах, в роли которых выступают NK-клетки. Получив сигнал, рецептор CD16 меняет свою конформацию, запуская внутриклеточный каскад химических реакций, в результате которых NK экспрессируют перфорины и гранзимы, которые, высвобождаясь, атакуют клетку-мишень. Перфорины проделывают в мембране опухолевой клетки поры, через которые её содержимое выходит наружу, а гранзимы, проникая внутрь их, запускают механизмы апоптоза.





Наша идея заключается в том, что, используя репортерную клеточную линию, мы моделируем клеточную цитотоксичность и можем тестировать кандидаты антител быстро, эффективно и воспроизводимо. Так мы сможем проанализировать их спецактивность и выбирать лучшие.
*Анализ цитотоксичности на клетках крови человека является многостадийным и неточным исследованием, что делает его сложным для использования в лабораториях.
  • Raji
    Клетки неходжкинской лимфомы - злокачественные В-лимфоциты
  • CD20
    Белок-рецептор на поверхности B-лимфоцитов, при оверэкспресии выступающий в роли маркера раковой клетки
  • Jurkat NFAT luc CD16
    Т-лимфоциты с искусственно встроенным человеческим CD16 рецептором и геном, кодирующим люциферазу
  • CD16 Fc receptor
    Мембранный белок NK-клеток
Клетка мишень - Raji
Эффекторная клетка - Jurkat

После соединения антитела с опухолевой и эффекторной клетками запускается каскад химических реакций, результатом которого является люминесценция Jurkat
Цель
Создать простую, быструю и воспроизводимую тест-систему для анализа эффективности анти-CD20-терапевтических антител
Задачи проекта
1
Получение клеточной линии
2
Разработка клеточного теста
3
Анализ кандидатов
Этапы работы
Культивирование клеток
Перед началом работы нам нужно было научиться размораживать клетки, пересевать и менять им среду.
Трансфекция
В нашем исследовании мы использовали три разных вида трансфекции: один физический - электропорация, и два химических - поликатионная и липофекция.
Флуоресцентная микроскопия
Для предварительной оценки трансфекции мы детективировали флуоресценцию на микроскопе.
Цитометрия
С помощью данного метода мы количественно оценили эффективность трансфекции.
Селекция
Селекция - это процесс отбора клеток на антибиотике. При трансфекции вместе с геном интереса мы добавляем гены устойчивости к антибиотику. Во время селекции мы добавляем антибиотик во флакон и выживают только те клетки, которые получили гены устойчивости.
Клонирование
После селекции, мы получаем гетерогенную популяцию, в которой клетки имеют разный уровень экспрессии гена интереса. Чтобы получить популяцию с одинаковым и высоким уровнем экспрессии, мы клонируем данный пул клеток. В результате мы получаем клеточный клон - популяцию клеток, полученнную из одной исходной родительской клетки.

Подбор оптимального соотношения количества клеток эффекторов к клеткам мишеням

Постановка и анализ серии клеточных тестов и выбор наилучшего соотношения количества клеток друг к другу.
Подбор концентрации антитела и шага титрования
Постановка и анализ серии клеточных тестов и выбор наилучшей концентрации антитела и шага титрования.
Подбор времени инкубации
Постановка клеточных тестов, их анализ и выбор более подходящего времени инкубации: с начала постановки теста до визуализации результатов.
Анализ кандидатов антител
Подобрав оптимальные условия для проведения теста, мы перешли к сравнению кандидатов антител
Результаты
1
Флуоресцентная микроскопия
Для отработки методики получения клеточной линии мы трансфецировали клетки линии HEK293 тремя разными сочетаниями плазмид:

  1. Плазмида, содержащая ген, кодирующий Tomato (красный флуоресцентный белок)
  2. Плазмида, содержащая ген, кодирующий GFP (зеленый флуоресцентный белок)
  3. Плазмидой GFP и Tomato одновременно
На иллюстрации изображены данные микроскопии.
Третья фотография - совмещенное изображение.

Tomato 100%

GFP 100%

Tomato 50% + GFP 50%

2
Проточная цитофлуометрия
Так как у нас было две разные культуры клеток: суспензионная (Jurkat E6.1) и адгезивная (HEK293), мы использовали два вида трансфекции: физический и химический.
Для химической трансфекции мы решили сравнить эффективность двух методов, поликатионной трансфекции и липофекции.
Для более точного анализа клеток после трансфекции мы применили метод проточной цитометрии.
HEK293
По данным с цитометра мы можем сделать вывод, что липофекция прошла более эффективно
Jurkat E6.1
3
Селекция
Для этого, заранее работники лабаратории трансфецировали нужную нам в дальнейшей работе клеточную линию Jurkat плазмидами которые содержали гены, кодирующие целевые белки (CD16 Fc и люцифераза) и гены устойчивости к антибиотикам.
Живые клетки агранулярные с четкой круглой формой, мертвые - гранулярные, бесформенные
4
Подбор оптимального соотношения клеток эффекторов к клеткам мишеням
Для того, чтобы подобрать наилучшее количество клеток для проведения теста, мы пробовали добавлять разные соотношения клеток
По результатам теста мы сделали вывод, что оптимумом для наших дальнейших экспериментов является соотношение 50 тысяч клеток мишеней на 50 тысяч клеток эффекторов, потому что разница между верхним и нижним плато максимальная

5
Подбор концентрации антитела и шага титрования
Для того чтобы подобрать наилучшую концентрацию антитела для проведения теста, мы пробовали увеличивать и уменьшать концентрацию и шаги титрования
Проанализировав график, мы поняли что лучшим будет 20.000 нг/мл при шаге титрования 10, потому что достигнуто верхнее и нижнее плато
6
Подбор времени инкубации
Далее мы подбирали различные временные промежутки для нашего клеточного теста
Оптимальным значением стало 6 часов, потому что достигается верхнее и нижнее плато, а также потому что это удобное время для ежедневной постановки клеточных тестов.

6
Анализ кандидатов антител
Мы использовали 4 разных кандидата
Мы проанализировали эффективность кандидатов, используя ЕC50. В нашем случае это показатель концентрации антитела, необходимой для достижения 50% эффекта. Мы определили лучший кандидат номер 3. Это соответствует уже имеющимся данным о кандидатах.
Выводы
1

Разработан клеточный тест, подобраны оптимальные условия: соотношение клеток-мишеней к клеткам-эффекторам 1:1 по 50 тысяч клеток каждой из линий, исходная концентрация антител 20.000 нг/мл с шагом титровки 10, время инкубации 6 и более часов.​

2

Проанализирована эффективность кандидатов с помощью EC50. Определён лучший кандидат №3, что соответствует уже имеющимся данным о кандидатах. ​


Тест-система может использоваться в лаборатории BIOCAD

Наша команда

  • Боровлева Полина

    Мать подсчета концентраций

  • Шавернев Матвей

    Молекулярный дед

  • Ломов Роман

    Философ без мысли, временно безработный

  • Макалева Анна

    Капаю в пробирки, а не на мозги

  • Гуртовая Екатерина

    Культивирую клетки, титрую мозги

  • Логинова Елизавета

    Вношу клетки, но не выношу мозги
Наши руководители

  • Козлова Екатерина

    За любой движ, кроме движа в несбалансированной центрифуге

  • Соловьев Валерий

  • Черных Юлия

  • Цветкова Анжела

  • Юнг Игорь

  • Абрамова Кристина

  • Шеуджен Тимур

    Люблю грозу в начале мая,
    Когда весенний первый гром...
    30 годиков, молекулярный биолог
Наши контакты:
+7 (915) 449-40-01
caterinagurtovaya@gmail.com