Генетика и биомедицина
Строение саркомера
Введение
Каждая мышечная клетка имеет в себе миофибриллы, которые состоят из саркомеров (функциональные единицы мышечных клеток). За сокращение мышечного волокна в саркомере отвечают белки актин и миозин. На миозине есть головки, которые передвигаются по нитям актина гребковыми движениями. Головки миозина прикрепляются к нити актина, сгибаются и хватаются в новом месте. Для осуществления этого процесса необходимо поддержание строгой упорядоченности актинового цитоскелета. Это осуществляется с помощью семейства белков филаминов.
Строение филамина С
Филамин С
Филамины— это семейство актин-связывающий белков, которые стабилизируют трехмерные сети F-актина, образуя гибкие молекулярные сшивки, Семейство содежит три гомологичных белка А, В, С. Филамины, А и В находятся во всех дифференцированных клетках позвоночных, филамин С ограничен мышечными клеткми, он локализован в области Z-диска саркомера, и связывает актив, в функциональном состоянии представляет собой димер.
Первое заболевание, связанное с мутацией в гене FLNC, было описано в 2005 году. Была идентифицирована нонсенс-мутация в области димеризационного домена FLNC, вызвавшая конечностно-поясную прогрессирующую мышечную дистрофию.
Миопатии
Миопатии – это группа мышечных заболеваний, характеризующихся нарушениями метаболизма и структуры поперечно-полосатой мышечной ткани.
Скелетно-мышечная миопатия составляет 19,8 до 25,1 случаев на 100 000 населения.Кардиомиопатия развивается у 50-60 человек на 100 000 населения.
Одна из причин развития миопатий - мутации в гене структурного белка филамина С.
Механизмы молекулярного патогенеза миопатий практически не изучены.
Цель
Изучение роли филамина С в молекулярных механизмах развития миопатии на клеточной модели, мышечных клетках линии С2С12 с нокаутом гена FLNC.
- 1Исследовать архитектуру актинового цитоскелета на разных стадиях дифференцировки мышечных клеток С2С12 с нокаутом гена FLNC.
- 2Оценить экспрессию генов актин-связывающих белков и маркеров мышечной дифференцировки: филаминов А и В, миозинов в дифференцированных миотрубках.
- 3Исследовать динамику внутриклеточной концентрации ионов кальция и амплитуду депо-опосредованного входа кальция.
- 1
Культуральная работа по ведению миобластов и получению дифференцированных миотрубок линии С2С12 контрольных и с нокаутом по гену филамина С
- 2
Визуализация актинового цитоскелета в миобластах и дифференцированных миотрубках методом цитохимической окраски
- 3
Выделение РНК из миобластов и дифференцированных миотрубок с помощью фенола
- 4
Анализ экспрессии генов интереса методом ПЦР с обратной транскрипцией
- 5
Оценка уровня белков-маркеров миогенеза методом Вестерн-блоттинга
- 6
Сравнение динамики внутриклеточного уровня ионов кальция в контрольных и нокаутных клетках методом кальциевого имиджинга
Дифференцировка клеток
По фотографиям, которые мы сделали, можно увидеть, что клетки WT раньше начинают вытягиваться и сливаться, образуя миотрубки, а у клеток, в которых отсутствует филамин С, процесс дифференцировки, вероятно, проходит менее эффективно, и на 3 день они все еще похожи на миобласты.
Этапы дифференцировки клеток линии С2С12 с получением миотрубок.
WT - клетки дикого типа;
FLNCko - клетки с нокаутом по гену FLNC.
Визуализация актинового цитоскелета
Актин обеспечивает механическую поддержку, определяет форму клетки и в мышечных клетках образует тонкие филаменты саркомеров.
У миобластов с нокаутом филамина С имеются более крупные гранулы актина и в большем количестве, чем у дикого типа.
В дифференцированных клетках дикого типа визуализируется актиновый цитоскелет по мышечному типу (вытянут вдоль миотрубок), чего не наблюдается в филаминовых нокаутах.
Для визуализации актинового цитоскелета был использован метод цитохимического окрашивания с использованием фаллоидина с флуоресцентной меткой Alexa Fluor 488, ядра были окрашены DAPI.
Выделение РНК
Выделение РНК было выполнено стандартным методом фенольной экстракции. Концентрация РНК была измерена с помощью NanoPhotometer (IMPLEN). С помощью электрофореза в агарозном геле была выполнена проверка качества РНК проб.
Результаты эксперимента
Анализ экспрессии генов интереса
В процессе мышечной дифференцировки, как на начальных, так и на поздних стадиях наблюдается увеличение экспрессии генов филаминов А и В в нокаутных клетках. Мы полагаем, что это компенсаторная реакция в ответ на отсутствие филамина С.
В контрольных клетках значительно выше экспрессия генов, задействованных в мышечной дифференцировке, чем в нокаутных клетках.
Анализ экспрессии генов интереса был выполнен с помощью метода ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени.
Оценка уровня белков-маркеров миогенеза.
В нокаутных клетках наблюдается очень низкий уровень белка филамина С на всех этапах дифференцировки, что говорит о релевантности модели.
В недифференцированных миобластах отсутствуют тяжелые цепи миозина, как в контроле, так и в нокауте. Миозины появляются при индукции дифференцировки, и их содержание растет в процессе дифференцировки, при этом в контрольных клетка сильнее, чем в нокаутных.
Оценка уровня белка выполнялась методом Вестерн-блот. Электрофорез проводился в 7,5% полиакриламидном геле, детектирование белка с помощью антител выполнялось на нитроцеллюлозной мембране.
Кальциевый имиджинг
Динамика депо-зависимого кальциевого входа и объём кальциевого депо регистрировались методом прижизненной эпифлуоресцентной микроскопии (кальциевый имиджинг) с использованием кальций связывающего зонда Fluo-4AM.
•SERCA – (Sarco/endoplasmic Reticulum Ca-ATPase) Ca-АТФаза сарко/эндоплазматического ретикулума. С помощью энергии гидролиза АТФ перекачивает Са2+ из цитоплазмы в СПР.•Тапсигаргин (10мкМ, 10мин) – блокатор Са-АТФазы ретикулума.
Блокирование SERCA приводит к выходу Са2+ из СПР и активации депо-опосредованного входа Са2+.
•EGTA (10мкМ) – хелатор Са2+.
Добавление EGTA во внешний раствор (0 mM Са2+) устраняет депо-зависимый вход Са2+.
Смена внешнего бескальциевого раствора на кальций-содержащий обеспечивает депо-зависимый вход Са2+.
Депо-опосредованный вход кальция
•STIM – трансмембранный белок на поверхности СПР (саркоплазматический ретикулум);
•Orai – Са2+-проницаемый канал на наружной мембране клетки;
Уменьшение концентрации Са2+ в СПР меняет конформацию белка STIM и он взаимодействует с каналом Orai, активируя и открывая его.
Нарушение архитектуры актинового цитоскелета может изменить это взаимодействие.
Нокаут гена FLNC замедляет дифференцировку клеток С2С12
Отсутствие белка филамина С вызывает образование актин-содержащих белковых агрегатов в недифференцированных мышечных клетках
Отсутствие белка филамина С вызывает компенсаторное усиление экспрессии генов FLNA и FLNB в процессе мышечной дифференцировки
При нокауте гена филамина С снижается экспрессия основных маркеров мышечной дифференцировки на уровне мРНК и белка
Отсутствие белка филамина С увеличивает кальциевый ответ дифференцированных клеток при ингибировании Са-АТФазы тапсигаргином и уменьшает амплитуду депо-опосредованного входа Са2+
- 21Дни интенсивной работы
- 8Человек в команде
- 34Сломанных стёкол
- Алексей Валерьевич КарпушевДоцент кафедры Биологии клетки и гистологии ИМО ФГБУ НМИЦ им. В.А. Алмазова, к.б.н.
akarpushev@yandex.ru
+79632442231 - Елена Владимировна Игнатьева
научный сотрудник ФГБУ НМИЦ им. В.А. Алмазова, к.б.н.
lefutr@mail.ru
Telegram @luchelenai
- Екатерина Сергеевна КлименкоМладший научный сотрудник
ФГБУ НМИЦ им. В.А. Алмазова
bymalvina@gmail.com
Telegram @bymalvina - Валерия Борисовна МихайловаЛаборант-исследователь
ФГБУ НМИЦ им. В.А. Алмазоваhastar.teerend@yandex.ru
Telegram @KrekSkrek
- Наборщикова Карина Сергеевнаkarina.naborshchikova.06@bk.ru
Telegram @Kaleriyans - Бабушкин Александр Александровичbabushkinchipik@gmail.com
Telegram @GoldenCobra23 - Ряховская Ксения Владимировнаrkv18032006@mail.ru
Telegram @rkv_rkv_rkv - Резниченко Вероника Борисовна33olive.oil@gmail.com
Telegram @strawberry_berry_ry
Выражаем благодарность
Лактюшкину Виктору Сергеевичуза помощь в работе с дорогостоящим оборудованием
Демидову Олегу Николаевичуза организацию исследовательского процесса
Ворониной Елене Николаевнеза сопровождение на протяжении всей программы
akarpushev@yandex.ru
konkurs@sochisirius.ru