Неустойчивый подсолнечник
И на подсолнухе есть пятна
Партнёры
- Всероссийский институт генетических ресурсов растений им Н.И. Вавилова
- Российская селекционно-семеноводческая компания RUSEED
Актуальность
Россия является мировым лидером по производству подсолнечника. Подсолнечник занимает 1 место по собранной биомассе среди масличных культур в России. Ежегодно собирается около 17 млн. тонн подсолнечника.
Ложная мучнистая роса (пероноспороз, ЛМР) представляет большую угрозу для урожая подсолнечника. Ежегодно из-за поражения патогеном теряется от 30 до 70% урожая семян
Россия является мировым лидером по производству подсолнечника. Подсолнечник занимает 1 место по собранной биомассе среди масличных культур в России. Ежегодно собирается около 17 млн. тонн подсолнечника.
Ложная мучнистая роса (пероноспороз, ЛМР) представляет большую угрозу для урожая подсолнечника. Ежегодно из-за поражения патогеном теряется от 30 до 70% урожая семян
Результаты опроса участников научно-технологической смены "Большие вызовы"
89,5% опрошенных используют продукты из подсолнечника не реже раза в неделю, что подтверждает важность нашего проекта для федеральной территории Сириус.
Гипотеза
Некоторые линии подсолнечника из коллекции ВИР обладают геном устойчивости к пероноспорозу, следовательно, могут быть использованы в ускоренной селекции
Некоторые линии подсолнечника из коллекции ВИР обладают геном устойчивости к пероноспорозу, следовательно, могут быть использованы в ускоренной селекции
Цель
Поиск линий подсолнечника, устойчивых к ложной мучнистой росе, для дальнейшего их использования в селекции
Мы каждый день работали в лабораториях и решали эти непростые задачи
Определить, какие линии подсолнечника из коллекции ВИР несут ген устойчивости
Доказать, что неустойчивые растения такого гена не имеют
Сделать заключения об устойчивости новых линий подсолнечника к ложной мучнистой росе
Таблица генов устойчивости
Ген Plarg защищает растения от всех рас Plasmopara halstedii, Pl6 — от большинства, Pl1 — от самой первой расы.
ДНК-маркеры
Для того, чтобы определить, находятся ли в исследуемом геноме гены интереса, используют ДНК-маркеры, сцепленные с этими генами. В нашей работе мы использовали SSR-, STS- и CAPS-маркеры
SSR-маркеры (simple sequence repeats) – последовательности ДНК (микросателлиты) от 3 до 9 нуклеотидов. Проводя ПЦР с праймерами, содержащими SSR-маркеры, мы видим различия (полиморфизмы) длины у линий с целевым геном и без него
STS-маркеры (sequence-tagged sites) - последовательности ДНК от 200 до 500 нуклеотидов, встречающиеся в геноме только один раз. Проводя ПЦР со специфичными праймерами, можно определить наличие связанного с этим маркером гена
CAPS-маркеры (cleaved amplified polymorphism sequence) - метод определения наличия целевого гена, основанный на различии длин выделенной ДНК после обработки рестриктазами. Добавив к продуктам ПЦР рестриктазы с сайтом рестрикции внутри целевого гена, мы сможем доказать его присутствие в исследованных линиях
ПЦР
Выделение ДНК
Рестрикция
Электрофорез
Этапы работы
1
2
3
Визуализация результатов электрофореза
3
5
4
О НАС
Методы работы
Для начала, мы выделили ДНК новых линий подсолнечника методом CTAB:
1) Мы измельчали замороженные листья подсолнечника тефлоновыми пестиками
2) После очищали ДНК различными растворами хлороформа и изоамилового спирта согласно протоколу
3) Удаляли супернатант
4) Очищенную ДНК разбавляли для дальнейшей работы
1) Мы измельчали замороженные листья подсолнечника тефлоновыми пестиками
2) После очищали ДНК различными растворами хлороформа и изоамилового спирта согласно протоколу
3) Удаляли супернатант
4) Очищенную ДНК разбавляли для дальнейшей работы
Выделение ДНК
Постановка ПЦР
После мы провели полимеразную цепную реакцию:
1) Подготовили миксы для ПЦР с праймерами ORS716, ORS509, HaP3, 4W2
2) Добавили ДНК с концентрацией 100 нг в количестве 2 мкл
3) Амплифицировали в соответствии с протоколом
4) Продукты ПЦР нанесли на горизонтальный электрофорез
1) Подготовили миксы для ПЦР с праймерами ORS716, ORS509, HaP3, 4W2
2) Добавили ДНК с концентрацией 100 нг в количестве 2 мкл
3) Амплифицировали в соответствии с протоколом
4) Продукты ПЦР нанесли на горизонтальный электрофорез
Спектрофотометрия
Результаты спектрофотометрии
Проведение электрофореза
Мы проводили горизонтальный электрофорез с продуктами ПЦР с целью визуализации искомого гена
1) Мы подготавливали 2%-й и 3%-й агарозный гель, окрашенный бромидом этидия
2) В продукты ПЦР добавляли буфер для окрашивания
3) Загружали генетический материал в лунки
4) Добавляли ДНК-маркеры разной длины (в зависимости от праймера)
1) Мы подготавливали 2%-й и 3%-й агарозный гель, окрашенный бромидом этидия
2) В продукты ПЦР добавляли буфер для окрашивания
3) Загружали генетический материал в лунки
4) Добавляли ДНК-маркеры разной длины (в зависимости от праймера)
ORS716
HaP3
4W2
Рестрикция
Для того, чтобы проверить наличие гена Pl1 в исследуемых линиях, мы проводили рестрикционный анализ с RSA I. Эта рестриктаза разрезает ампликоны, полученные при ПЦР с праймерами 4W2, на два фрагмента в 340 и 30 нуклеотидов. Далее мы проводили электрофорез продуктов рестрикции и измеряли их длину.
Разработанная компанией SibEnzyme рестриктаза RSA I является доступным аналогом американской рестриктазы Tsp509I, которая ранее применялась в исследованиях на гены устойчивости. Мы впервые использовали RSA I в подобных исследованиях и доказали ее эффективность
Разработанная компанией SibEnzyme рестриктаза RSA I является доступным аналогом американской рестриктазы Tsp509I, которая ранее применялась в исследованиях на гены устойчивости. Мы впервые использовали RSA I в подобных исследованиях и доказали ее эффективность
Маркер Step-100
370 bp
340 bp
ВИР 381
ВИР 388
ВИР 343
ВИР 183
ВИР 768
ВИР 452
ВИР 370
ВИР 340
Отрицательный контроль
Мы провели спектрофотометрический анализ выделенной ДНК для измерения её концентрации
Исходя из значений концентрации тотальной ДНК, мы рассчитали необходимое разведение для проведения ПЦР
Результаты
1
Ген Plarg
Линии ВИР 381 и ВИР 370 имеют ген устойчивости Plarg
2
Ген Pl6
линия ВИР 183 имеет ген устойчивости Pl6
3
Ген Pl1
линии ВИР 343, ВИР 183, ВИР 768 и ВИР 452 имеет ген устойчивости Pl1
План развития
- АнализАнализ новых генов устойчивости подсолнечника к ЛМР
- ИсследованиеИсследование других линий подсолнечника, устойчивых к ЛМР
- ПрименениеПрименение устойчивых линий в селекции
Участники проекта
Мельникова Миленаг. Самара
Домрачев Владимир
г. Владивосток
Галактионова Анастасия
г. Смоленск
Ильин Егор
г. Новосибирск
Кононов Сергей
г. Балашиха
Руководители нашей команды
Наши руководители проекта помогали нам в трудных ситуациях, были теми, на кого мы могли положится и всецело им доверять
- Рязанова Мария Константиновнамладший научный сотрудник лаборатории генетики, селекции и биотехнологии декоративных и ягодных культур ВИР им. Н.И.Вавилова
- Белова Маргарита Константиновнамагистрантка 1 курса направления “Генетика и биотехнология растений” НТУ “Сириус”
Контакты
+7 927 236 64 66
unstablesunflowers@yandex.ru
+7 927 236 64 66
unstablesunflowers@yandex.ru
Краснодарский край, пгт. Сириус
