Постановки ПЦР и электрофореза
1
Расчёт смеси ПЦР

2
Постановка полимеразной цепной реакции
3
Приготовление агарозного геля для электрофореза
4
Постановка электрофореза
5
Проявление результатов в ChemiDoc
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Это метод с достаточно высокой точностью и специфичностью.
Цикл ПЦР имеет три стадии:
  1. Денатурация, это процесс разрушения водородных связей между двумя цепями ДНК, происходит при температуре ~95 градусов.
  2. Отжиг праймера, это процесс связывания праймера и комплементарным ему участком ДНК, происходит при температуре 40-72 градуса.
  3. Элонгация, процесс достраивания цепочки ДНК с использованием дезоксирибонуклеозидтрифосфатов при помощи ДНК-полимеразы.
Обычно производят от 30 до 40 циклов ПЦР, при каждом цикле число молекул удваивается.

Рисунок (эл. ресурс biomolecula.ru)

Схема ПЦР






Таблица:

Состав смеси

ПЦР на 20 мкл

Маркеры, которые мы использовали
SCoT-маркер (Start Codon Targeted)
Мультилокусный маркёр, направленный на фланкирующие последовательности
  • 1
    Простота и экономичность:
    SCoT-PCR не требует предварительной информации о последовательности генома.
  • 2
    Высокая информативность:
    SCoT маркер - это мультилокусный маркер, направленный на множество полиморфных участков, фланкирующих старт кодон
  • 3
    Универсальность:
    Метод применим для различных видов растений, включая картофель.

Мы провели ПЦР-анализ с каждой выделенной ДНК из образцов. На картинке отмечен маркер (100bp+), проба №1 представляет собой ПЦР продукт на матрице ДНК из листовых проростков, ПЦР продукт ДНК in vitro образца представлен под №2 и гербарный материал под №3, в 5 лунке находится отрицательный контроль.

На данной электрофореграмме, во всех 3-х пробах мы видим 6 ампликонов разной длины (730; 600; 420; 390; 250 п.н.) это говорит нам, о принадлежности растений к одному сорту.


Электрофореграмма (SCoT)

SSR (Simple Sequence Repeats)
Монолокусный маркер основанный на полиморфизме микросателлитных последовательностей генома
  • 1
    Высокая полиморфность:
    Повторы в SSR маркерах очень вариабельны, что делает их эффективными для внутривидового различения между сортами.
  • 2
    Кодоминантность:
    SSR маркеры могут выявлять различия между гомозиготными и гетерозиготными состояниями аллелей.
  • 3
    Широкое распространение:
    Микросателлиты присутствуют во всех организмах, включая картофель.



На данной электрофореграмме, во всех 3-х пробах, мы наблюдаем микросателлитные последовательности одинаковой длины (286-295 п.н.), это говорит нам о принадлежности всех проб к одному сорту.


Электрофореграмма (SSR)

Назад