Схема выделения ДНК набором ЭКСТРАН-3
Выделение ДНК из микрорастений in vitro и листовых проростков картофеля
Выделение ДНК из клеточных культур - базовый этап при исследовании организма на молекулярном уровне.
Чаще всего выделение производят уже готовыми наборами, как и в нашем случае, для выделения ДНК из микрорастений in vitro и листовых проростков картофеля мы использовали набор ЭКСТРАН-3 (Синтол).
Выделение ДНК происходит в несколько этапов:
- Разрушение клеточной стенки и мембраны клетки происходит под действием лизирующего раствора, в состав которого входят детергенты.
- Чтобы наша проба не содержала фрагменты РНК, мы добавляем фермент, разрушающий её, а именно РНКазу.
- Дальше мы производим очистку от белков, фенолов, метаболитов и прочей грязи, которая повлияет на качество нашей пробы.
- Последним этапом мы производим элюцию ДНК в специальном растворе, после чего она готова к дальнейшим манипуляциям.
Качество и количество выделенной ДНК мы можем определить при помощи специального прибора Нанодропа, который проводит спектральный анализ поглощения света определённой длины волны (280 нм) молекулой ДНК.
Процессы деградацииВ тканях гербарных образцов возможны различные деструктивные процессы, приводящие к
фрагментации молекул ДНК и к различным повреждениям, ингибирующим работу полимераз
и негативно влияющих на корректное включение нуклеотидов при проведении ПЦР. В процессе сушки растений, повреждения ДНК обусловлены
в основном действием нуклеаз, высвобождающихся при гибели клеток, а также микробными
нуклеазами, выделяемыми микроорганизмами,
заселяющими растение.
Применение хлороформа и формалина при гербаризацииПри гербаризации и в процессе хранения образцы обрабатываются различными химическими веществами. Многие использующиеся при этом реагенты: этанол, метанол, формалин, хлороформ и др. производят необратимое разрушающее действие на ДНК уже через 24 часа после замачивания растений.
Кроме того, обработка растений этанолом снижает общий выход выделяемой из них ДНК по
сравнению с растениями, высушенными на воздухе.
Большое количество вторичных метаболитовПомимо изменения самой структуры молекул ДНК, при работе с гербарными образцами
существенной проблемой является присутствие
в растениях большого количества полисахаридов и накопление окисленных вторичных метаболитов, таких как окисленные полифенолы. Эти соединения
препятствуют нормальной работе полимераз и
рестриктаз, и загрязненная ими ДНК малопригодна для дальнейшего молекулярного анализа.
Условия храненияПри длительном хранении гербарных образцов на стабильность молекул ДНК воздействуют
различные факторы окружающей среды, такие
как температура, влажность и pH. В гербариях
чаще всего создаются условия для поддержания
постоянной температуры и влажности, но до сих
пор огромное количество образцов гербария закреплены на кислотной бумаге, которая может
увеличивать скорость депуринизации.
В связи с данными фактами, мы можем сделать вывод, что выделение ДНК из гербария – достаточно сложный процесс, который требует многократных очисток от вторичных метаболитов, выделяемых растением.