В поисках ингибиторов кальцификации
Проект выполнен в рамках научно-технологической программы «‎Большие вызовы»
июль 2024
Введение
Ежегодно в мире проводится более 500 тыс. операций по замене кальцинированных клапанов сердца. Все эти операции связаны с большими рисками, поэтому поиск ингибиторов против патологической кальцификации является важным направлением исследований, направленных на разработку методов предотвращения и лечения подобных патологий
Гипотезы
We work hard every day to make life of patients better and happier
  • 1
    Сигнальный путь Notch
    Ингибирование сигнального пути Notch может быть использовано для лечения патологической кальцификации без инвазивного вмешательства.
  • 2
    Пиностробин
    Препарат пиностробин ингибирует остеогенную дифференцировку интерстициальных клеток и может действовать подобно кренигацестату.
Подробнее о проекте
Кальцификация — это процесс отложения кальция в тканях организма, который может привести к различным заболеваниям, включая стеноз аортального клапана. Стеноз аортального клапана — это сужение просвета клапана, которое препятствует нормальному кровотоку из левого желудочка в аорту. Данная патология является крайне опасной и может привести к смерти. Единственным лечением на данный момент является хирургическое удаление кальцифицированного клапана. Но такие операции связаны с большими рисками, и поэтому необходимо найти иные способы лечения данного заболевания.

Причина заболевания может быть связана с мутацией генов NOTCH. Cпектр мутаций NOTCH1 включает в себя широкий круг патологий, затрагивающих весь выносящий отдел сердца. Также вероятной причиной могут быть сбои сигнального пути Notch, поломки широкого спектра сердечно-сосудистых заболеваний.

В проекте мы работаем с интерстициальными клетками клапана (ИКК), в которых откладываются соли кальция. ИКК являются наиболее склонными к остеогенной дифференцировке и патологической кальцификации.

В исследовании производится оценка двух ингибиторов остеогенной дифференцировки ИКК: кренигацестата — синтетической малой молекулы — и пиностробина — флавоноида. Наша задача — проверить, на сколько эти ингибиторы могут ингибировать остеогенную дифференцировку. А в качестве контроля эксперимента мы используем лентивирусные конструкции:

NICD (внутриклеточный домен Notch), индуцирующая остеогенную дифференцировку, положительный контроль;
shCSL, несущая шпилечные РНК для ингибирования сигнального пути Notch, отрицательный контроль.
Модель эксперимента
  • 1
    Культура клеток
    Используются первичные культуры клеток (ИКК - интерстициальные клетки клапана, ЛФ - легочные фибробласты)

  • 2
    Индукция дифференцировки

    Добавление остеофакторов таких, как дексаметазон(Dex), аскорбиновая кислота (Asc) и β-глицерофосфат (β-Glic)

  • 3
    Мониторинг
    Анализ различными методами
    После исследований результаты оцениваются и подводиться итог

Методы
Культивирование клеток
Нами культивировались интерстициальные клетки клапана и клетки легочных фибробластов
МТТ-тест
Используется для оценки жизнеспособности клеток и цитотоксичности ингибиторов
ПЦР в реальном времени
Применяется для анализа количественного уровня экспрессии интересующих нас генов (ген мишень сигнального пути Notch - HEY 1; гены мишени Runx2; гены домашнего хозяйства)
Иммуноцитохимия
Позволяет визуализировать конкретные белки цитоскелета (α-SMA, виментин) клетки, что необходимо для изучения процессов дифференцировки клеток
Вестерн блот
Позволяет определить присутствие и количественно оценить конкретные белки в образце, что полезно для изучения влияния ингибиторов на остеогенную дифференцировку
Окрашивание ализарином
Применяется для обнаружения кальциевых солей, в нашем случае, при изучении процессов кальцификации или остеогенеза в клетках
Результаты
  1. Пиностробин в нетоксичных концентрациях подавляет остеогенную. дифференцировку интерстициальных клеток аортального клапана
  2. Пиностробин снижает активность сигнального пути Notch.
  3. Пиностробин при индукции остеогенной дифференцировки снижает содержание основного регулятора остеогенной дифференцировки белка Runx2, а также экспрессию связанного с остеогенной дифференцировкой гена, кодирующего периостин.
  4. Ранние этапы остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток аортального клапана связаны с накоплением виментина и гладкомышечного актина и таким образом действуют на самых ранних этапах остеогенной дифференцировки.
  5. Пиностробин может быть рассмотрен как кандидат для создания терапии против патологической кальцификации.
Наши партнеры
Наша команда
  • Малашичева
    Анна Борисовна
    Доктор биологических наук, заведующая Лабораторией регенеративной биомедицины Института цитологии РАН , руководитель НИГ Молекулярных механизмов кальцификации НЦМУ «Центр персонализированной медицины» Национального медицинского исследовательского центра им. В. А. Алмазова, доцент кафедры эмбриологии биологического факультета СПбГУ

  • Смирнова

    Дарья Владимировна

    Младший научный сотрудник Лаборатории регенеративной биомедицины Института цитологии РАН
  • Громова Екатерина Сергеевна
    Старший лаборант-исследователь Лаборатории регенеративной биомедицины Института цитологии РАН
  • Караман
    Ирина Александровна
    Студент Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого по направлению "Биотехнические системы и технологии"
Перечитать все заново