Научно-технологическая проектная программа
"Большие вызовы"
Экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости у бактерий
Генетика и биомедицина
Партнёры проекта
Актуальность
Антибиотикорезистентность - тема, волнующая всё человечество. На данный момент существуют очень скромные способы борьбы с устойчивостью у бактерий. За последние несколько десятилетий не было разработано ни одной новой молекулы антибиотика, соответственно, на рынке не появились новые лекарства для лечения инфекционно -воспалительных процессов.

В настоящее время почвенные бактерии активно используются в сельском хозяйстве для повышения урожайности. На них постоянно воздейтсвуют различные стрессовые факторы, из-за которых увеличивается экспрессия генов, отвечающих за механизмы антибиотикорезистентности. С помощью горизонтального переноса генов данные механизмы могут передаваться от почвенных бактерий патогенным, что вызывает потенциальную опасность.
В данном исследовании мы изучаем работу эффлюксных насосов, которые выбрасывают из клетки чужеродные вещества.
В нашей работе мы остановились на изучении данных генов эффлюксных насосов (MsbA, KpnH и KpnF), а также генов транскрипционных факторов (CRP и RsmA), регулирующих работу эффлюксных насосов.
Исследуемые гены
Штаммы бактерий
•GMG_278 Enterobacter ludwigii(В); •GMG_288 Lelliottia amnigena(Д); •GMG_294 Rahnella aquatilis(М);
•GMG_165.2 Stenotrophomonas lactitubi(А); •GMG_952 Pantoea agglomerans(Я)

CRP- представляет собой важный фактор транскрипции
MsbA- является единственным бактериальным транспортером
KpnH- нарушение компонентов помпы KpnG-KpnH значительно снижает устойчивость к антибиотикам
KpnF- участвует в устойчивости к противомикробным препаратам
RsmA- РНК-связывающий белок, который регулирует процессы,важные для выживания
Использованные антибиотики
ЛЕВ (Левомицетин), КАН (Канамицин), ПОЛ (Полимиксин), СТР (Стрептомицин), ЭНР (Энрофлоксантин),
НЕО (Неомицин), ТЛЗ (Тилозин), АМП (Ампициллин), ТЕТ (Тетрациклин), ПЕН (Бензилпенициллин)


Гипотеза
Бактерии при стрессовых условиях включают сверхэкспрессию генов эффлюксных насосов, что приводит к повышенному выведению антибиотиков из клетки, в результате чего может развиться антибиотикорезистентность.
Стрессовые факторы
Тяжёлые металлы
К наиболее опасным загрязнителям почв относят тяжелые металлы
Инкубирование культуры бактерий с солями:
•Кобальт азотнокислый
•Никель азотнокислый
Гербициды
Используются для обработки от сорняковых растений
Инкубирование культуры бактерий с гербицидом хизалофоп-п-этил («Миура»)
Засоление
Инкубирование культуры бактерийс хлоридом натрия 5%, 7%, 10%
ЦЕЛЬ
Исследовать экспрессию генов эффлюксных насосов при введении бактерий в стрессовые условия
Задачи
  • 1
    Определить минимальные ингибирующие концентрации для стрессовых факторов, при которых бактерии будут находиться в состоянии стресса, но всё ещё сохранять жизнеспособность.
  • 2
    Проанализировать изменение профиля антибиотикорезистентности при помещении бактерий в различные стрессовые условия.
  • 3
    Проанализировать изменение экспрессии генов, участвующих в работе эффлюксных насосов, при помещении бактерий в различные стрессовые условия.
Приготовление жидкой и плотной питательных сред LB, их автоклавирование, посев на них 5 исследуемых штаммов бактерий в стерильных условиях. Добавление в питательные среды дополнительных компонентов, моделирующих "стрессовые" условия
Определение МИК (для солей Co(NO3)2, Zn(NO3)2, Ni(NO3)2, NaCl и гербицида) методом серийных разведений и измерение оптической плотности среды (OD650) на спектрофотометре.
1
Приготовление питательных сред
3
Этапы работы
Определение минимальных ингибирующих концентраций
Выделение ДНК и РНК методом преципитации (набор "Рибопреп", Интерлабсервис) и методом сорбции на магнитных частицах (набор MRP-100, Биолабмикс) с последующей оценкой концентрации и чистоты выделенных нуклеиновых кислот на спектрофотометре NanoDrop.
Выделение нуклеиновых кислот
3
Постановка ОТ-ПЦР в режиме реального времени и сравнение дифференциальной экспрессии генов методом delta-deltaCt
Оптимизация работы праймеров в ПЦР с градиентом температуры отжига с последующим проведением электрофореза в 2%-агарозном геле
Сравнение дифференциальной экспрессии генов
3
Проведение ПЦР с последующим электрофорезом
Определение антибиотикорезистентности диско-диффузионным методом
Постановка диско-диффузионного метода для определения фенотипической антибиотикорезистентности
Результаты
Минимальные ингибирующие концентрации
Определение МИК нитрата кобальта
Минимальная ингибирующая концентрация - наибольшая концентрация катионов тяжёлых металлов, при которой бактерии находятся в состоянии стресса, но ещё сохраняют жизнеспособность.
Определение МИК нитрата никеля
На основе полученных мы построили диаграммы из которых можно определить минимальную ингибирующую концентрацию для каждого штамма бактерий при нитрате кобальта и нитрате никеля.
Суммарный эффект стрессовых факторов на фенотип антибиотикорезистентности (-1 – увеличение чувствительности, 1 – появление промежуточного фенотипа, 2 – появление АБР).

В целом можно сказать, что влияние стрессовых факторов на развитие АБР носит в большей степени индивидуальный для каждого штамма характер. Однако, суммарно, можно выделить, что чаще всего развивается устойчивость к аминогликозидным АБ на фоне добавления гербицида и засоления.



Анализ экспрессии генов эффлюксных насосов при нахождении бактерий в стрессовых условиях
Пример диаграммы для анализа изменения экспрессии генов эффлюксных насосов в ответ на стресс (добавление гербицида для штамма 288).
В результате проведенных исследований можно отметить, что мы не наблюдаем закономерностей в отношении влияния экспрессии генов эффлюксных насосов и возникновения АБР в исследуемых штаммах. Так штаммы 952 и 294, которые очень похожи по профилю возникновения АБР, резко отличаются по экспрессии всех исследованных генов.



Анализ главных компонент для объединенных данных по экспрессии генов эффлюксных насосов и АБР для исследуемых штаммов.
При проведении совместного анализа данных по экспрессии генов эффлюксных насосов и АБР для исследуемых штаммов методом главных компонент, можно выделить три кластера, которые соответствуют разным штаммам. Это также говорит об индивидуальной реакции штаммов в отношении различных стрессов.

Выводы
  • 1
    Влияние стрессовых факторов на развитие антибиотикорезистентности носит в большей степени индивидуальный для каждого штамма характер. Однако, суммарно, можно выделить, что чаще всего развивается устойчивость к аминогликозидным антибиотикам на фоне добавления гербицида и засоления.
  • 2
    Экспрессия генов эффлюксных насосов для каждого штамма индивидуально меняется в зависимости от вида стрессового фактора. Нет глобавльного увеличения экспрессии всех насосов, кроме штамма Pantoea agglomerans в ответ на действие гербицидов и тяжелых металлов.
  • 3
    Значительное увеличение экспрессии ни одного из изучаемых эффлюксных насосов не влияет на возникновении антибиотикорезистентности при воздействии стрессовых факторов на бактерии.
Заключение
В почвенных бактериях при попадании в стрессовые условия (засоленность, загрязнение гербицидами) может развиваться антибиотикорезистентность, что при постоянстве воздействия данных факторов может приводить к возникновению новых мутаций/генов, передающихся патогенным бактериям. Таким образом, при выборе микробиологических удобрений важно проверять бактерии на устойчивость к таким стрессовым факторам.
Наша команда
Участники:
Наставники:
  • Михаил Юрьевич Карташов
    Руководитель проекта
    Кандидат биологических наук, заведующий сектором молекулярной диагностики ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора, старший преподаватель СУНЦ НГУ
    mikkartash@yandex.ru
  • Елена Николаевна Воронина
    Методист направления
    Кандидат биологических наук, заведующая группой молекулярной генетики ИХБФМ СО РАН, доцент СУНЦ НГУ, заведующая лабораториями биологического направления Регионального центра Новосибирской области «Альтаир»
    voronina_en@inbox.ru
  • Светлана Ивановна Камалова
    Руководитель проекта
    Кандидат биологических наук, доцент кафедры фармацевтической технологии и биотехнологии СибГМУ
    kamalovasi90@gmail.com
Обратная связь